組織の形態および組織に含まれる核酸の安定性保持に良好な骨組織脱灰法の検討

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【研究目的】本研究の目的は、組織学的、分子生物学的解析に有効な骨組織パラフィン包埋標本の作製過程における適切な脱灰操作法の構築である。強酸性のpHからなる迅速脱灰液は、カルシウム塩の溶出効果が高い半面、脱灰後に核酸の断片化が生じやすい。これに対してEDTAなどの中性脱灰液は、核酸への損傷が少ない半面、カルシウム塩の溶出に時間がかかる。そこで、脱灰時におけるカルシウム塩の溶出効果を高めるうえで有効であるとされる超音波処理を利用し、組織学的・分子生物学的解析の両者に有用な脱灰操作法を検討した。【研究方法】マウスの大腿骨を対象標本として、強酸性の迅速脱灰液であるプランクリクロおよびK-CX、そして中性脱灰液であるEDTA-2Naの3種類の脱灰液を準備し、迅速脱灰装置による超音波処理の有無でそれぞれ脱灰処理を行う。処理後にパラフィン包埋ブロックを作製し、染色用と核酸抽出用の切片を用意する。組織学的解析用にHE染色、分子生物学的解析用にPCR反応を実施し、それらを脱灰液の種類と超音波処理の有無で総合的に比較して、「EDTA+超音波」の有用性を評価する。【研究成果】HE染色では、超音波処理を施した3種類の脱灰処理標本とも、未処理のものと比べ染色性が良好であった。PCR反応では、キレート剤脱灰処理標本のみにDNA産物が検出されたが、超音波処理の有無による差は認められなかった。以上のことから超音波処理はいずれの脱灰液に対しても組織学的解析に有用であることが確認されたが、分子生物学的解析に対する有用性は認められなかった。「EDTA+超音波」の評価には更なる検討を要する結果となったが、超音波処理による脱灰操作は今後の病理診断業務に利用可能であると思われる。