新規スギヒラタケレクチンPPL2の精製法の確立と急性脳症に関わる特性解析

新型柳杉凝集素PPL2纯化方法的建立及其与急性脑病相关特性的表征

• 批准号: 25915003
• 负责人: 坂上 ひろみ
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: Ochanomizu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25915003/
• 关键词: スギヒラタケ; レクチン; 糖特異性

東北・北陸地方で摂取されるスギヒラタケ。2004年と2007年、摂取者の中に急性脳症を発症しさらに腎機能障害をもつ複数の患者が死亡した。この原因物質と発症メカニズムの解明を目的として本研究を進めた。1. PPL2の改良精製法の確立(1)スギヒラタケ子実体からPBS抽出し、遠心上清の硫安沈殿画分をPBSに対して透析して抽出液とした。(2)精製用吸着体の調製 : セファロース4Bゲルをエポキシ活性化した後アミノ化し、還元アミノ化により最も結合性の高い糖(α-Gal、β-Gal)を含むメリビオース、ラクトースおよびラクトN-ネオテトラオース(LNnT)を結合させ、残存アミノ基をブロックした。(3)メリビアミル、ラクタミル、LNnTセファロースカラムにそれぞれ抽出液をアプライして洗浄した後、各糖溶液で溶出した結果、それぞれのアフィニティクロマトグラフィーから14kDのタンパク質が得られ、既報のスギヒラタケレクチンPPL (Suzuki, et al (2009))とは異なる、ガラクトース結合性新規レクチンPPL2を見出した。2. PPL2の糖特異性解析(1) ELISA法による糖結合性解析 : マイクロプレートに種々濃度のPPL2を固定化し、様々な糖BPプローブとの結合性を解析した。PPL2はα-Galと強く特異的に結合する一方でβ-Galとの結合性が示されず、精製方法との矛盾があるのでさらに究明したい。(2)表面プラズモン共鳴(SPR)による相互作用解析 : CM5センサーチップに様々なオリゴ糖鎖-Fmoc-アミノ酸を固定化し、アナライトとしてPPL2との相互作用をBIACORE2000を用いて解析した。PPL2はラクトサミンの直列リピートおよび二本鎖分枝構造に等しく結合することを見出し, 論文報告した(Carbohyd. Res. 382, 77-85, 2013)。3. PPL2と細胞との相互作用PPL2は未処理ヒト赤血球凝集反応を示した。PPL2を5-DTAFで蛍光標織した後、A、B、O型ヒト赤血球と混合して顕微鏡で観察したところ蛍光が微弱だったので、さらなる観察条件の検討が必要である。今後はPPL2について、様々な細胞上の結合リガンド、細胞内取り込みの有無、神経軸索成長への影響を測定、観察する予定である。

In the Hokuriku region, で摂 is taken as されるスギヒラタケ. と 2004, 2007, who の に in acute 脳 を 発 disease し さ ら に renal function handicap of を も つ plural の patients died が し た. <s:1> The causative substance と the cause メカニズム the purpose を the objective と the て this study を further めた. 1. PPL2 の improved refined method (1) の established ス ギ ヒ ラ タ ケ son be body か ら PBS take し, far heart clear の sulfur AnShenDian draw points を PBS に し seaborne て dialysis し て extract と し た. (2) Preparation of refined adsorbents: セ フ ァ ロ ー ス 4 b ゲ ル を エ ポ キ シ activeness し た after ア ミ ノ し, yuan also ア ミ ノ change に よ り most も associativity の い high sugar (alpha Gal, beta - Gal) contains を む メ リ ビ オ ー ス, ラ ク ト ー ス お よ び ラ ク ト N - ネ オ テ ト ラ オ ー ス (LNnT) を さ せ, residual ア ミ ノ base を ブ ロ ッ ク し た. (3) メ リ ビ ア ミ ル, ラ ク タ ミ ル, LNnT セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム に そ れ ぞ れ extract を ア プ ラ イ し て し at た で dissolution, the sugar solution after し た results, そ れ ぞ れ の ア フ ィ ニ テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー か ら 14 kd の タ ン パ ク qualitative が must ら れ, both reported の ス ギ ヒ ラ タ ケ レ ク チ ン PPL (Suzuki, et al. (2009)) と は different な る, ガ ラ ク ト ー ス associative rules レ ク チ ン PPL2 を shows し た. 2. PPL2 の sugar specificity analysis (1) ELISA method に よ る sugar associativity analytic: マ イ ク ロ プ レ ー ト に 々 concentration の PPL2 を immobilized し, others 々 な sugar BP プ ロ ー ブ と の associativity を parsing し た. Strong PPL2 は alpha Gal と く specific に combining す る side で beta Gal と の associativity が shown さ れ ず, refined methods と の contradiction が あ る の で さ ら に investigate Ming し た い. (2) the surface プ ラ ズ モ ン resonance (SPR) に よ る interaction analytic: CM5 セ ン サ ー チ ッ プ に others 々 な オ リ ゴ sugar lock - Fmoc - ア ミ を ノ acid immobilized し, ア ナ ラ イ ト と し て PPL2 と の interaction を BIACORE2000 を with い て parsing し た. PPL2 は ラ ク ト サ ミ ン の inline リ ピ ー ト お よ び 2 lock branch structure に し く combining す る こ と を see し, paper し た (Carbohyd. Res., 382, 77-85, 2013). 3. PPL2と cell と <s:1> interaction PPL2と untreated ヒト red blood cell agglutination reverse 応を shows た た. PPL2 を 5 - DTAF で 蛍 cursor woven し た after, A, B, O ヒ ト red blood corpuscle と mixed し て 顕 micromirror で 観 examine し た と こ ろ 蛍 が faint light だ っ た の で, さ ら な る 観 examine condition の beg が 検 necessary で あ る. Future は PPL2 に つ い て, others 々 な cells の combining リ ガ ン ド, intracellular り 込 み の, god 経 axon growth へ の を measuring and examines 観 す る designated で あ る.

项目成果

お茶の水女子大学理学部化学科・大学院人間文化創成科学研究科 小川温子研究室ホームページ

御茶水女子大学理学部、化学系、人文科学研究生院、小川敦子研究室主页

新規スギヒラタケレクチンの精製と糖特異性解析 Purification and characterization of a novel lectin from the fruiting body of P. porrigens

一种来自 P. porrigens 子实体的新型凝集素的纯化和表征

• 发表时间: 2013
• 作者: Kosuke Nakamura#;Hiromi Sakagami#;Kimie Asanuma-Date;Nao Nagasawa;Yoshiaki Nakahara;Hiroshi Akiyama;Haruko Ogawa (^#Equal contribution;共第一著者);深沢英乃・坂上ひろみ・長澤奈央・中村公亮・伊達公恵・小川温子;深沢英乃・坂上ひろみ・吉田奈央・中村公亮・穐山浩・小川温子
• 通讯作者: 深沢英乃・坂上ひろみ・吉田奈央・中村公亮・穐山浩・小川温子

固定化Fmoc-アミノアシル糖鎖を用いたSPRによる新規スギヒラタケレクチンの糖特異性解析

使用固定化 Fmoc-氨基酰基糖链通过 SPR 对新型日本柳杉凝集素进行糖特异性分析

• 发表时间: 2013
• 作者: Kosuke Nakamura#;Hiromi Sakagami#;Kimie Asanuma-Date;Nao Nagasawa;Yoshiaki Nakahara;Hiroshi Akiyama;Haruko Ogawa (^#Equal contribution;共第一著者);深沢英乃・坂上ひろみ・長澤奈央・中村公亮・伊達公恵・小川温子;深沢英乃・坂上ひろみ・吉田奈央・中村公亮・穐山浩・小川温子;深沢英乃・坂上ひろみ・吉田奈央・中村公亮・小川温子
• 通讯作者: 深沢英乃・坂上ひろみ・吉田奈央・中村公亮・小川温子

新規スギヒラタケレクチン(Pleurocybella porrigens leGtin 2 = PPL2)の精製と特性解析

新型 Pleurocybella porrigens LeGtin 2 = PPL2 的纯化和表征

• 发表时间: 2013
• 作者: Kosuke Nakamura#;Hiromi Sakagami#;Kimie Asanuma-Date;Nao Nagasawa;Yoshiaki Nakahara;Hiroshi Akiyama;Haruko Ogawa (^#Equal contribution;共第一著者);深沢英乃・坂上ひろみ・長澤奈央・中村公亮・伊達公恵・小川温子;深沢英乃・坂上ひろみ・吉田奈央・中村公亮・穐山浩・小川温子;深沢英乃・坂上ひろみ・吉田奈央・中村公亮・小川温子;坂上ひろみ・深沢英乃・吉田奈央・中村公亮・小川温子
• 通讯作者: 坂上ひろみ・深沢英乃・吉田奈央・中村公亮・小川温子

Immobilized glycosylated Fmoc-amino acid for SPR : comparative studies of lectin-binding to linier or biantennary diLacNAc

用于 SPR 的固定化糖基化 Fmoc-氨基酸：凝集素与线性或双触角 diLacNAc 结合的比较研究

• 发表时间: 2013
• 期刊: Carbohydrate Research
• 影响因子: 3.1
• 作者: Kosuke Nakamura#;Hiromi Sakagami#;Kimie Asanuma-Date;Nao Nagasawa;Yoshiaki Nakahara;Hiroshi Akiyama;Haruko Ogawa (^#Equal contribution;共第一著者)
• 通讯作者: 共第一著者)