ＤＮＡマーカーによるトノサマガエルとダルマガエルの非侵害的種判別法の開発

絶滅が危惧されているトノサマガエル(Pelophylax nigromaculata), ナゴヤダルマガエル(Pelophylax porosa brevipoda), トウキョウダルマガエル(Pelophylax porosa porosa)の3種は種特異的な形態的特徴はあるとされているが, 形態的に非常に類似しており, 学術図鑑等においても形態的な識別点が明瞭に記されていない. また, 特に近年遺伝子汚染で問題となっているトノサマガエルとダルマガエルのF1雑種においては形態での判断は極めて難しいとされている. 本研究では, 当該3種において, 個体を傷つけること無くDNAの抽出を試み, PCRによる種判別が可能なDNAマーカーの探索を行った. 非侵害的DNA抽出法については、排泄腔を滅菌済みの綿棒で拭った後に綿棒をDNA抽出溶液に浸し、その沈殿物を用いてDNA抽出を行ったところ、DNAの抽出に成功した。種判別DNAマーカーについては、RAG1遺伝子の一部の領域1188bpを増幅させるプライマーを設計しPCRしたところ3種全てで増幅を確認し、ダイレクトシークエンスで塩基配列を決定した。得られた塩基配列中にはダルマガエルの885bpに制限酵素PvuIIサイトがあり、トノサマガエルには存在しないためこれを用いてRFLPによる種判別法を行った。PCR産物を制限酵素処理しエタノール沈殿後に電気泳動により確認を行ったところ、トノサマガエルには1.2kbのバンド、ダルマガエル2種には880bpのバンドがそれぞれ確認され、このバンドパターンにより種判別が可能であることが分かった。雑種においてはトノサマガエルとトウキョウダルマガエルの雑種①、トノサマガエルとナゴヤダルマガエルの雑種②どちらにおいてもトノサマガエルとダルマガエル両方のバンドパターンが確認されることから雑種であると判断することが可能であった。

絶滅が危惧されているトノサマガエル(Pelophylax nigromaculata), ナゴヤダルマガエル(Pelophylax porosa brevipoda), トウキョウダルマガエル(Pelophylax porosa porosa)の3種は種特異的な形態的特徴はあるとされているが, 形態的に非常に類似しており, 学術図鑑等においても形態的な識別点が明瞭に記されていない. また, 特に近年遺伝子汚染で問題となっているトノサマガエルとダルマガエルのF1雑種においては形態での判断は極めて難しいとされている. 本研究では, 当該3種において, 個体を傷つけること無くDNAの抽出を試み, PCRによる種判別が可能なDNAマーカーの探索を行った. 非侵害的DNA抽出法については、排泄腔を滅菌済みの綿棒で拭った後に綿棒をDNA抽出溶液に浸し、その沈殿物を用いてDNA抽出を行ったところ、DNAの抽出に成功した。種判別DNAマーカーについては、RAG1遺伝子の一部の領域1188bpを増幅させるプライマーを設計しPCRしたところ3種全てで増幅を確認し、ダイレクトシークエンスで塩基配列を決定した。得られた塩基配列中にはダルマガエルの885bpに制限酵素PvuIIサイトがあり、トノサマガエルには存在しないためこれを用いてRFLPによる種判別法を行った。PCR産物を制限酵素処理しエタノール沈殿後に電気泳動により確認を行ったところ、トノサマガエルには1.2kbのバンド、ダルマガエル2種には880bpのバンドがそれぞれ確認され、このバンドパターンにより種判別が可能であることが分かった。雑種においてはトノサマガエルとトウキョウダルマガエルの雑種①、トノサマガエルとナゴヤダルマガエルの雑種②どちらにおいてもトノサマガエルとダルマガエル両方のバンドパターンが確認されることから雑種であると判断することが可能であった。