鉄酸化細菌で発見した新規水銀気化酵素の解析及び水銀除去への利用

铁氧化细菌中发现的一种新的汞蒸发酶的分析及其在汞去除中的应用

基本信息

批准号：
26925025
负责人：
杉尾剛
金额：
$ 0.32万
依托单位：
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26925025/
关键词：
Acidithiobacillus ferrooxidans cytochrome oxidase reduction of mercury

项目摘要

申請者が自然界から単離した高度水銀耐性鉄酸化細菌Acidithiobacillus ferrooxidans MON-1株は、水銀に耐性な従属栄養細菌で存在が知られている水銀還元酵素(MerA)を持つとともに、2価鉄を電子供与体にする新規な水銀還元気化酵素活性を持っていた。解析の結果、本来鉄酸化酵素の末端酸化酵素として機能しているcytochrome oxidase(COase)が、還元型cytochrome cあるいは2価鉄を電子供与体にしてHg^<2+>をHg^0に還元することが明らかとなった。今回、下記の課題Ⅰ、及びⅡに関して検討し、明らかになった点を報告する。課題I. Cytochrome oxidase(COase)による水銀還元気化機構の解明鉄細菌も含め細菌のCOaseは、3種類のサブユニット(α-、β-、γ-subunits)から構成されている。これまで、どのサブユニットが塩化水銀の還元気化に関与しているかについては明らかにされていない。今回MON-1株よりCOaseを精製単離した後、SDSを用いて各subunitsに解離し、更に、Sephadex G-100カラムクロマトグラフィー操作を2回繰り返す事によりα-及びβ-subunitsを単離できた。γ-subunitは分子量が小さくSephadex G-100の操作では単離できなかった。α-subunitは単独でCOase活性を示したが、β-subunitはCOase活性を示さなかった。また、α-subunitは、塩化第二水銀に対して弱い水銀還元気化活性を示したが、β-subunitは示さなかった。4μgのα-subunitによる水銀還元気化活性は、6μgのβ-subunitの添加によって4.8倍に増加した。以上の結果より、MON-1株由来COaseによる水銀の還元気化活性はα-及びβ-subunitsの”協同作業”によって行われている、と結論した。課題Ⅱ. 固定化MON-1株洗浄細胞を用いての水銀還元気化の最適化水銀耐性鉄酸化細菌MON-1株の洗浄細胞を水銀のバイオレメディエーションに利用するため、MON-1株細胞の固定化を試みた。20日間電気培養して得たMON-1株細胞を0.5%, 1.0%, 1.5%のアルギン酸ソーダ水溶液に懸濁後、塩化カルシュウム水溶液中に滴下することによって、直径3mmの球形固定化ゲルを得た。固定化菌体の鉄酸化活性は0.5%、1.0%、1.5%アルギン酸固定化菌体で、それぞれ3.2, 2.8, 2.4μmol Fe^<2+>oxidized・min^<-1>・mg protein^<-1>であった。固定化菌体の鉄酸化活性は5回の再使用によってもほぼ変化はなかったが6回以上の再使用では少しずつ低下し、10回の再使用では最初の60%の活性を示した。鉄酸化酵素活性の高さが直接水銀還元気化活性に関わっているので、今回得た固定化MON-1株細胞を用いて水銀の気化活性を検討する予定である。

高度抗汞的铁氧化细菌酸硫硫代菌二硫代杆菌由申请人从自然中分离出的MON-1菌株具有汞还原酶（MERA），已知是一种对汞抗性的异育细菌，并且具有新型的汞含量活性，将分裂铁作为电子供体的新型汞活性。分析表明，最初用作铁氧化酶的末端氧化酶的细胞色素氧化酶（COASE）将Hg^<2+>降低至Hg^0，并使用还原的细胞色素C或Divalent Iron作为电子供体。这次，我们将在下面讨论I和II问题，并报告已揭示的观点。问题I.细菌（包括铁细菌）中细胞色素氧化酶（COASE）鸡的汞再生机理的阐明，由三种类型的亚基（α-，β-和γ-亚基）组成。到目前为止，尚未透露哪些亚基参与振兴氯化汞。从MON-1菌株中纯化和分离COase后，使用SDS将其解散到每个亚基中，此外，可以通过重复两次Sephadex G-100柱色谱法分离α-和β-subunits。 γ-亚基的分子量很小，无法通过Sephadex G-100的操作分离。 α亚基单独显示co碱活性，而β-亚基则没有表现出coase活性。此外，α-亚基对汞继发氯化物的汞再生活性弱，但β-亚基没有。加入6μg的β-亚基，通过4μgα-亚基的汞再生活性增加了4.8倍。从以上结果得出结论，源自MON-1的汞的再生活性是通过α-和β-亚基之间的“合作工作”进行的。建议II。使用固定的MON-1菌株洗涤细胞优化汞再生，以利用氧化汞的氧化细菌MON-1菌株的洗涤细胞进行汞的生物修复，我们试图固定MON-1菌株细胞。将通过电养殖获得20天获得的MON-1应变细胞悬浮在0.5％，1.0％和1.5％藻酸钠水溶液中，然后滴入氯化钙溶液中，以获得直径为3 mm的球形固定凝胶。固定细胞的氧化活性为0.5％，1.0％和1.5％藻酸固定细胞，分别为3.2、2.8和2.4μmolFe^<2+>氧化，分别为min^<-1>，mg蛋白^<-1>。即使在五个重用后，固定细菌的铁氧化活性也几乎没有变化，但是在六个或更多的重用后逐渐降低，并且在10个重复使用后显示了最初的60％活性。由于高铁氧化酶活性与汞再生活性直接相关，因此我们计划使用这次获得的固定的MON-1应变细胞研究汞的蒸发活性。