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鉄酸化細菌で発見した新規水銀気化酵素の解析及び水銀除去への利用

铁氧化细菌中发现的一种新的汞蒸发酶的分析及其在汞去除中的应用

基本信息

批准号：
26925025
负责人：
杉尾剛
金额：
$ 0.32万
依托单位：
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26925025/
关键词：
Acidithiobacillus ferrooxidans cytochrome oxidase reduction of mercury

项目摘要

申請者が自然界から単離した高度水銀耐性鉄酸化細菌Acidithiobacillus ferrooxidans MON-1株は、水銀に耐性な従属栄養細菌で存在が知られている水銀還元酵素(MerA)を持つとともに、2価鉄を電子供与体にする新規な水銀還元気化酵素活性を持っていた。解析の結果、本来鉄酸化酵素の末端酸化酵素として機能しているcytochrome oxidase(COase)が、還元型cytochrome cあるいは2価鉄を電子供与体にしてHg^<2+>をHg^0に還元することが明らかとなった。今回、下記の課題Ⅰ、及びⅡに関して検討し、明らかになった点を報告する。課題I. Cytochrome oxidase(COase)による水銀還元気化機構の解明鉄細菌も含め細菌のCOaseは、3種類のサブユニット(α-、β-、γ-subunits)から構成されている。これまで、どのサブユニットが塩化水銀の還元気化に関与しているかについては明らかにされていない。今回MON-1株よりCOaseを精製単離した後、SDSを用いて各subunitsに解離し、更に、Sephadex G-100カラムクロマトグラフィー操作を2回繰り返す事によりα-及びβ-subunitsを単離できた。γ-subunitは分子量が小さくSephadex G-100の操作では単離できなかった。α-subunitは単独でCOase活性を示したが、β-subunitはCOase活性を示さなかった。また、α-subunitは、塩化第二水銀に対して弱い水銀還元気化活性を示したが、β-subunitは示さなかった。4μgのα-subunitによる水銀還元気化活性は、6μgのβ-subunitの添加によって4.8倍に増加した。以上の結果より、MON-1株由来COaseによる水銀の還元気化活性はα-及びβ-subunitsの”協同作業”によって行われている、と結論した。課題Ⅱ. 固定化MON-1株洗浄細胞を用いての水銀還元気化の最適化水銀耐性鉄酸化細菌MON-1株の洗浄細胞を水銀のバイオレメディエーションに利用するため、MON-1株細胞の固定化を試みた。20日間電気培養して得たMON-1株細胞を0.5%, 1.0%, 1.5%のアルギン酸ソーダ水溶液に懸濁後、塩化カルシュウム水溶液中に滴下することによって、直径3mmの球形固定化ゲルを得た。固定化菌体の鉄酸化活性は0.5%、1.0%、1.5%アルギン酸固定化菌体で、それぞれ3.2, 2.8, 2.4μmol Fe^<2+>oxidized・min^<-1>・mg protein^<-1>であった。固定化菌体の鉄酸化活性は5回の再使用によってもほぼ変化はなかったが6回以上の再使用では少しずつ低下し、10回の再使用では最初の60%の活性を示した。鉄酸化酵素活性の高さが直接水銀還元気化活性に関わっているので、今回得た固定化MON-1株細胞を用いて水銀の気化活性を検討する予定である。

Applicant: Acidithiobacillus ferrooxidans MON-1, a highly mercury tolerant ferro acidifying bacterium isolated from nature, is a member of the genus Actinobacillus ferrooxidans, and is known to exist in the presence of mercury reducing enzyme (MerA). As a result of the analysis, it has become clear that cytochrome oxidase(COase), the terminal acidifying enzyme of ferric-acidifying enzyme, has a specific function, and that the reducing type cytochrome c can reduce Hg^<2+> by Hg^0 as an electron donor. The following topics are discussed in this paper and will be reported in the future. Topic I. Cytochrome oxidase(COase) is the chemical mechanism of mercury reduction. It is composed of three kinds of enzymes (α-, β-, γ-subunits). This is the first time that a person has been exposed to mercury. The MON-1 strain was purified by COase, and the SDS was used to dissociate and reform each subunit. Sephadex G-100 was used to purify α-and β-subunits. The γ-subunit has a small molecular weight. Sephadex G-100 is operated independently.α-subunit alone shows COase activity, β-subunit shows COase activity. The α-subunit shows the chemical activity of the second mercury. The activity of mercury reduction in 4μg α-subunit was 4.8 fold higher than that in 6μg β-subunit. The above results show that MON-1 strain is derived from COase and mercury reduction activity, and α-and β-subunits are synergistic. Subject II. Optimization of Mercury Reduction in Immobilized MON-1 Cells by Ferroacidobacteria MON-1 Immobilized MON-1 Cells MON-1 cells were isolated from 0.5%, 1.0%, and 1.5% aqueous solutions by electric culture during the day. The acidifying activity of immobilized cells was 0.5%, 1.0%, 1.5% respectively. The acidifying activity of immobilized cells was 3.2, 2.8, 2.4μmol Fe^<2+>oxidized·min^<-1>·mg protein^<2+><-1>. The activity of immobilized bacteria was reduced by 5 cycles of reuse, decreased by 6 cycles, and decreased by 60% of the initial activity after 10 cycles of reuse. The high ferricase activity is related to the direct mercury reduction activity. The high ferricase activity in immobilized MON-1 cells was studied by using mercury reduction activity.