肝小胞体蓄積病（ＨＥＲＳＤ）を呈する異常フィブリノゲン症の解析

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肝小胞体蓄積病(hepatic endoplasmic reticulum storage disease ; HERSD)は、肝細胞で産生された異常タンパク質が小胞体(ER)に蓄積し肝硬変を引き起こす病態である。本研究ではHERSDを呈する異常フィブリノゲン(Fbg)症に着目して、HERSDの発症機序を分子生物学的に明らかにすることを目的としている。1. 変異Fbg産生HuH-7細胞の作成と蛍光抗体法本来のFbg産生臓器である肝細胞の癌由来細胞株HuH-7細胞に変異Fbg cDNAを導入し、変異Fbg産生HuH-7細胞を作製した。現在までに、変異Fbg産生CHO細胞において抗Fbg抗体による蛍光抗体法で細胞質に特徴的な封入体(繊維状・粗大顆粒状)を発見している。今回作製した変異Fbg産生HuH-7細胞においても、CHO細胞と同様の封入体を認めた。2. GFP遺伝子の導入と封入体形成過程の観察(1)蛍光タンパク質GFPの遺伝子を変異Fbg cDNAに融合させ、CHO細胞に導入した。蛍光顕微鏡によるタイムラプス機能を用いて封入体形成過程を観察する予定であったが、今回作製したGFP付加変異Fbg産生CHO細胞では封入体を確認できなかった。変異Fbg cDNAのC末端側にGFP遺伝子を融合させたが、C末端はFbgの組み立てに重要な部位であり、GFPを融合させたことでFbgの組み立てが阻害された可能性が考えられた。(2)上記の方法では封入体形成過程を観察できなかったため、現在までに封入体を確認できた変異Fbg産生CHO細胞を用いて、培養1、2、3、4、7日における封入体割合を観察した。培養日数が経過するにつれて、繊維状封入体の割合が増加していくことが判明した。3. 封入体形成性とER関連分解の検討(1)封入体形成性を確認するために、[Aα鎖+変異γ鎖]産生CHO細胞、[Bβ鎖+変異γ鎖]産生CHO細胞、[変異γ鎖]産生CHO細胞の3種類の変異CHO細胞を新たに作製した。今回作製した変異CHO細胞では封入体は観察されず、封入体はFbgとして組み立てられることで初めて形成されることが判明した。(2)小胞体ストレスの観点から、上記の細胞および変異Fbg産生CHO細胞を用いてER関連分解マーカーの発現を確認した。蛍光抗体法およびウェスタンブロッティングで、細胞種類におけるマーカー発現量の違いを解析中である。