フィブリノゲン蓄積病モデル細胞を用いたフィブリノゲン機能解析と蓄積動態の解明

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申請者は、これまでにフィブリノゲン蓄積病（FSD）報告例の遺伝子変異を対象に、リコンビナントフィブリノゲン（Fbg）安定発現細胞株を樹立し、それらのFSDモデル細胞を用いたFSDの病態解明に取り組んでいる。2022年度は、これまでに樹立したFSDモデル細胞のうち、G284R・D316N・R375Wの遺伝子変異を有する3種類のモデル細胞株について、小胞体に蓄積したFbgをターゲットにした解析に取り組んだ。細胞内に蓄積したFbgを回収するために、小胞体内タンパクを特異的に標識する色素と反応させ、その反応色素に対する抗体とプロテインAビーズを用いた免疫沈降法によるFbg回収を検証した。免疫沈降法で得られたサンプルをSDS-PAGEで確認したところ、CBB染色でFbgのバンドは確認できなかったが、Westernblottingではバンドの存在を確認可能であった。様々な条件でFbgの高濃度回収を試みたが、標識色素を用いた免疫沈降法では困難であると判断し、標識色素の代わりに抗Fbg抗体を使用した免疫沈降法（代替法）を検証したところ、CBB染色でFbgのバンドを確認することができ、十分量の細胞内Fbgを回収することが可能となった。SDS-PAGEで得られたFbgバンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化を行った後、液体クロマトグラフィー質量分析計(LC-MS)を用いてFbgと結合しているタンパクの同定を行う予定である。