次世代シーケンサー・Ｌｉｑｕｉｄ　ｂｉｏｐｓｙによる卵巣癌の遺伝子変異検索

使用下一代测序仪液体活检寻找卵巢癌的基因突变

• 批准号: 26931016
• 负责人: 栗川 怜子
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26931016/
• 关键词: Cell Free DNA; Liquid Biopsy; 全エクソン解析

血中遊離DNA(Cell Free DNA(以下cfDNA))において採血から遠心分離までの時間による影響を明らかとするため、遠心分離までの時間を置いてcfDNAの回収量を比較したところ、目的としたサイズのcfDNA回収量は遠心分離までの時間的影響を受けなかった。しかしながら、総DNA収量を測定したところ28.40(5分), 31.85(15分), 32.20(30分), 32.20(60分), 54.00(120分)(ng)と増加し、時間経過に伴いcfDNA以外のDNA量が増加していることがわかった。このことからcfDNA回収においては遠心分離までの時間を短く、出来れば1時間以内にすることでcfDNA以外のDNAの混入を少なく防げることがわかった。次に、卵巣癌患者血漿から得られたcfDNA25ngからDNAライブラリーを調製する際に2種類の微量検体用プロトコールを用い、次世代シーケンサーにて全エクソン解析を行った。両法共に2億リードの塩基配列を得たが、エクソン領域にマップされた割合は各々33%と75%でありターゲット領域増幅率が有意に異なった。このように、全エクソン解析のライブラリー調製に用いるにふさわしい試薬を選出することが出来た。腫瘍組織でみられた遺伝子変異がcfDNAでも同定され、腫瘍由来のDNAを反映していることが確認された。例として、腫瘍DNA(25ng)におけるTP53遺伝子のC>A変異が107リード中96リードに認められたのに対し、TP53遺伝子のC>A変異が121リード中5リードに認められ、cfDNA中に腫瘍由来のDNAは4%含まれていると推定された。よって、cfDNAのような微量検体からでも全エクソン解析による遺伝子変異検出が可能であることが示された。最後に、腹水症例において網羅的遺伝子変異解析を行うことでLiquid Biopsyの意義を検討した。原発巣・播種巣全てに共通して検出された変異のうち100%(68/68)が腹水でも検出された。原発巣での変異遺伝子に限定すると腹水中での変異検出率は36.7%(125/341)に留まったが、大網・腹膜播種巣に共通な変異では95.2%(79/83)と高率であった。腹水中の腫瘍DNAは原発巣よりも大網等の播種巣をより反映していると考えられた。

Cell Free DNA in the blood DNA (the following cfDNA)) に お い て in pursuance of か ら telecentric separation ま で の time に よ る influence を Ming ら か と す る た め, telecentric separation ま で を の time buy い て cfDNA の 収 amount back を compare し た と こ ろ, purpose と し た サ イ ズ の cfDNA 収 amount back は telecentric separation ま で の を affected by the influence of time け な か っ た. し か し な が ら, 総 DNA amount 収 を し た と こ ろ 28.40 (5 points), 31.85 (15 points), 32.20 (30 points), 32.20 (60), 54.00 (120) (ng) と raised し, time 経 に with い cfDNA outside の DNA in が raised add し て い る こ と が わ か っ た. こ の こ と か ら cfDNA back 収 に お い て は telecentric separation ま で の を short く, out れ ば 1 time within に す る こ と で cfDNA の の を with less DNA than な く anti げ る こ と が わ か っ た. に, egg 巣 cancer patients plasma か ら have ら れ た cfDNA25ng か ら DNA ラ イ ブ ラ リ ー を modulation す る interstate に trace 検 body with 2 kinds の プ ロ ト コ ー ル を い, next generation シ ー ケ ン サ ー に て full エ ク ソ ン parsing line を っ た. That struck the intense に 200 million リ ー ド の salt base with column を must た が, エ ク ソ ン field に マ ッ プ さ れ た cut close は each 々 33% 75% と で あ り タ ー ゲ ッ ト field raised rate が intentionally に different な picture っ た. こ の よ う に, whole エ ク ソ ン parsing の ラ イ ブ ラ リ ー に modulation with い る に ふ さ わ し い try 薬 を elected す る こ と が た. Swollen sores organization で み ら れ た heritage 伝 sub - different が cfDNA で も with fixed さ れ, swollen sores origin の DNA を reflect し て い る こ と が confirm さ れ た. Example と し て, swollen sores DNA (25 ng) に お け る TP53 heritage 伝 の C > A son - 107 different が リ ー ド in 96 リ ー ド に recognize め ら れ た の に し seaborne, TP53 but 伝 の C > A - different が 121 リ ー ド five リ ー ド に recognize め ら れ, に swollen sores origin の DNA in cfDNA は 4% containing ま れ て い る と presumption さ れ た. よ っ て, cfDNA の よ う な trace 検 body か ら で も full エ ク ソ ン parsing に よ る heritage 伝 sub - 検 out が may で あ る こ と が shown さ れ た. Finally に, ascites syndrome cases に お い て snare the legacy of 伝 sub - different analytical line を う こ と で Liquid Biopsy の meaning を beg し 検 た. All the original and seeded nests are てに common and て検 produce された variation うち100%(68/68)が ascites で で 検 produce された. Original 発 巣 で の - different heritage 伝 son に qualified す る と ascites in で の - different は 検 rate 36.7% (125/341) に leave ま っ た が, net, peritoneal seeding 巣 に common な - different で high rate 95.2% (79/83) と は で あ っ た. The DNA of the abscess in ascites, the origin of the pathogen, よ よ, <s:1> seeding nests such as the large network, をよ, をよ reflect that <s:1> て, ると and えられた are found in えられた.