キサンチン酸化酵素における非ヘム鉄の機能に関する研究

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大量発現系の構築について申請書に記載した昆虫細胞による大量発現系の構築については完成をみた。和研薬社のセルマスターシステムの導入より1.5リッター規模という昆虫細胞としては大規模な発現系を安定して運用することが可能となった。また、通常のスピナ-フラスコを用いてもほぼ同規模の培養が可能な体制となった。組み換えウイルスの作製についてキサンチン脱水素酵素の[2Fe-2S]センターのリガンドと考えられるシステイン残基をセリンへと変換した組み換えウイルス数種の作製に成功した。また、それら変異酵素を解析して得られた結果をふまえて新たな変異酵素の作製に入っている。変異酵素の解析について得られた2種の変異酵素(C51S、C115S)について精製法を確立し、数ミリグラムの精製標品を得るに至った。これらの精製した変異酵素についてEPRスペクトルの測定を行った。2種の変異酵素とも2種の[2Fe-2S]センターに由来するシグナルが認められ、システインに替わってセリンがリガンドとなっていることが推測された。この結果に基づき、非ヘム鉄を完全に欠失した変異酵素を得るため、上記システイン残基をセリンではなくアラニンへと変換した変異酵素(C51A,C115A)を現在作製中である。このEPR測定によって2個の[2Fe-2S]センターについてそれぞれを形成するモチーフが推定できた。現在はこれらの変異酵素について酸化還元滴定、種々の基質を用いた活性測定など、更なる解析を行っている。