X線結晶構造解析及び、部位特異的変異法によるキサンチン脱水素酵素の構造・機能の研究

キサンチン脱水素酵素はヒトにおいてはプリン分解系の最終段階を触媒する酵素であり、キサンチンを尿酸に代謝する。もう一方の基質はNADであるが、酵素分子の高次構造の変化により、酸素を基質とするキサンチン酸化酵素へ変換することが知られている。このとき酵素反応の生成物として生ずる活性酸素が虚血再還流障害などの組織障害の原因となっているという多くの報告がある。本研究期間においては、結晶構造解析と部位特異的変異酵素の機能の解析を更に進めることにより、キサンチン脱水素酵素、酸化酵素の活性酸素生成機構に焦点を当て、これを解明中である。1)酵素(部位特異的変異酵素も含む)と基質アナログ、阻害剤との複合体の結晶構造の解析を行い、活性中心付近の反応メカニズムの推測を行った。より正確な議論を行うため、現在得られている結晶構造についても結晶化条件を改良するなどして分解能を高め、リファインメントを続けている。2)結晶構造より推測された活性酸素生成機構上重要であると考えられるアミノ酸残基を適宜変換した部位特異的変異酵素の作成を行う。FADと酸素との反応性を制御していると考えられる鉄硫黄中心のリガンド、あるいはその周辺のアミノ酸残基についても変換酵素の作成を行った。これら変異酵素について分光学的測定と、酵素学的解析(種々の基質、阻害剤に対するキネティカルなデータの収集、ストップドフローなどによる速度論的解析)を行い、既に得られている天然型酵素のデータとの比較を行うことによりFADにおける活性酸素生成機構に対する周囲アミノ酸の影響を解析中である。

キサンチン脱水素酵素はヒトにおいてはプリン分解系の最終段階を触媒する酵素であり、キサンチンを尿酸に代謝する。もう一方の基質はNADであるが、酵素分子の高次構造の変化により、酸素を基質とするキサンチン酸化酵素へ変換することが知られている。このとき酵素反応の生成物として生ずる活性酸素が虚血再還流障害などの組織障害の原因となっているという多くの報告がある。本研究期間においては、結晶構造解析と部位特異的変異酵素の機能の解析を更に進めることにより、キサンチン脱水素酵素、酸化酵素の活性酸素生成機構に焦点を当て、これを解明中である。1)酵素(部位特異的変異酵素も含む)と基質アナログ、阻害剤との複合体の結晶構造の解析を行い、活性中心付近の反応メカニズムの推測を行った。より正確な議論を行うため、現在得られている結晶構造についても結晶化条件を改良するなどして分解能を高め、リファインメントを続けている。2)結晶構造より推測された活性酸素生成機構上重要であると考えられるアミノ酸残基を適宜変換した部位特異的変異酵素の作成を行う。FADと酸素との反応性を制御していると考えられる鉄硫黄中心のリガンド、あるいはその周辺のアミノ酸残基についても変換酵素の作成を行った。これら変異酵素について分光学的測定と、酵素学的解析(種々の基質、阻害剤に対するキネティカルなデータの収集、ストップドフローなどによる速度論的解析)を行い、既に得られている天然型酵素のデータとの比較を行うことによりFADにおける活性酸素生成機構に対する周囲アミノ酸の影響を解析中である。