肝臓における誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現機構の解析

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1)ヒトゲノムDNAからPCR法によりiNOS遺伝子の転写開始点上流約1kbpをクローニングした。2)上記のDNAを制限酵素で切断したあるいは合成したオリゴヌクレオチドをアニールしたものの末端をラベルしてゲルシフトアッセイ用のプローブを作製した。3)ラット初代培養肝細胞を調製しIL-1βで刺激して核抽出物を調製し、2)で調製したプローブを用いてゲルシフトアッセイを行った。その結果、IL-1βの刺激に応答して蛋白の結合が変化する領域を把握した。4)一方、1)で調製したクローン化したDNAから、種々の欠失変異体およびIL-1βの刺激に応答する領域の候補に変異を導入したプロモーター変異体を作製し、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子と連結したプラスミド・ベクターを作製した。これらを初代培養肝細胞に導入してプロモーター活性を測定したところ、転写開始点上流-400bpが転写活性に重要な役割を果していることがわかった。同領域にはIL-1βの刺激に応答する領域としてC/EBP siteやNF-kB siteが存在したので、これらシスエレメントに変異を導入したところ、C/EBP siteの変異体でプロセーター活性の減少が認められた。5)これらのシスエレメントに結合する転写因子としてC/EBPファミリイ蛋白やRelホモロジイ蛋白の発現ベクターをリポータープラスミドとともにコトランスフェクトとして転写活性を測定した。結論3)、4)、5)の結果から肝細胞おいてIL-1βの刺激によりC/EBPやNF-kBがiNOS遺伝子プロモーターに結合して転写調節を行っていることが明らかとなった。6)同定された転写因子の他に別の因子がiL-1βの刺激によるiNOS遺伝子の転写調節に関わっている可能性があり、その同定が今後の課題である。