ラット初代培養肝細胞を用いた高リン刺激伝達経路の解明

利用原代培养的大鼠肝细胞阐明高磷刺激传递途径

• 批准号: 22H00943
• 负责人: 中井 雄治
• 金额: $ 10.9万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H00943/
• 关键词: リンシグナル; DNAマイクロアレイ; 初代培養肝細胞; 遺伝子発現

本研究では、高リン刺激が脂質代謝のシグナル伝達を解明することを目的として、ラット初代培養肝細胞を用いて遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイで明らかにし、その遺伝子発現を誘導する上流因子の解明を目指す。令和4年度は、ラット初代培養肝細胞の入荷が遅れた影響で、全体的にやや遅れが生じたが、まず高リン刺激の条件検討を行った。具体的には、細胞の播種条件（細胞密度）、培地に添加するリン酸塩（KH2PO4）の濃度、刺激時間および細胞回収方法である。SDラット由来初代培養肝細胞であるHEP134-Mを用い、24 well collagen coat plateに1.25×10^5、2.5×10^5の密度で播種を行い、5時間後に培地交換を行って12-24時間の前培養を行った。その後、リン酸塩含有培地に交換して、8時間、24時間と経時的に観察を行った。その結果、10 mMのリン酸塩添加では死細胞が生じること、3 mM添加では24時間経過でも顕著な異常が認められなかったこと、2.5×10^5播種では細胞が積み上がる傾向がみられることなどから、1.25×10^5の密度で播種、3 mMのリン酸塩添加（リン酸塩の終濃度4 mM）で本実験を行うこととした。また、ISOGEN II（ニッポンジーン）を用いて細胞を回収し、RNAを調製した結果、収量が十分とはいえなかったため、今後はRNeasy micro kitのbuffer RLTで回収し、カラム精製を直接行うこととした。今後は令和4年度に決定した条件で再度初代肝細胞を培養・刺激し、遺伝子発現変動をDNAマイクロアレイで解析する。

The purpose of this study was to elucidate the expression of lipid metabolism in primary cultured hepatocytes using DNA sequencing and the induction of gene expression in these hepatocytes. In order to investigate the effects of load on primary cultured hepatocytes in 2004 and 2005, the conditions for growth and stimulation of hepatocytes were discussed. Specific conditions, cell seeding conditions (cell density), concentration of KH2PO4 added in culture, stimulation time, and cell recovery method are described. HEP134-M was cultured on a 24-well collagen coat plate at densities of 1.25×10^5 and 2.5×10^5. After the test, the test results include the test results of 8 hours and 24 hours. The results showed that 10 mM acid was added to the cells, and 3 mM acid was added to the cells, and the cells tended to accumulate after 24 hours. 2.5× 10^5 seeding density was 1.25× 10^5 seeding density. 3 mM acid was added to the cells, and the final concentration of acid was 4 mM. Moreover, ISOGEN II (ンー) has been used to recover cells and modulate RNA. As a result, the amount of revenue has increased to 10%. In the future, the buffer RLT of the RNeasy micro kit will be recovered, and the refinement of Karma will be carried out directly. In the next four years, the conditions for culture, stimulation and gene expression of primary hepatocytes will be determined.