ラット初代培養肝細胞を用いた高リン刺激伝達経路の解明

利用原代培养的大鼠肝细胞阐明高磷刺激传递途径

基本信息

批准号：
22H00943
负责人：
中井雄治
金额：
$ 10.9万
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H00943/
关键词：
リンシグナル DNAマイクロアレイ初代培養肝細胞遺伝子発現

项目摘要

本研究では、高リン刺激が脂質代謝のシグナル伝達を解明することを目的として、ラット初代培養肝細胞を用いて遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイで明らかにし、その遺伝子発現を誘導する上流因子の解明を目指す。令和4年度は、ラット初代培養肝細胞の入荷が遅れた影響で、全体的にやや遅れが生じたが、まず高リン刺激の条件検討を行った。具体的には、細胞の播種条件（細胞密度）、培地に添加するリン酸塩（KH2PO4）の濃度、刺激時間および細胞回収方法である。SDラット由来初代培養肝細胞であるHEP134-Mを用い、24 well collagen coat plateに1.25×10^5、2.5×10^5の密度で播種を行い、5時間後に培地交換を行って12-24時間の前培養を行った。その後、リン酸塩含有培地に交換して、8時間、24時間と経時的に観察を行った。その結果、10 mMのリン酸塩添加では死細胞が生じること、3 mM添加では24時間経過でも顕著な異常が認められなかったこと、2.5×10^5播種では細胞が積み上がる傾向がみられることなどから、1.25×10^5の密度で播種、3 mMのリン酸塩添加（リン酸塩の終濃度4 mM）で本実験を行うこととした。また、ISOGEN II（ニッポンジーン）を用いて細胞を回収し、RNAを調製した結果、収量が十分とはいえなかったため、今後はRNeasy micro kitのbuffer RLTで回収し、カラム精製を直接行うこととした。今後は令和4年度に決定した条件で再度初代肝細胞を培養・刺激し、遺伝子発現変動をDNAマイクロアレイで解析する。

在这项研究中，为了阐明由于磷酸刺激引起的脂质代谢的信号传导，我们旨在使用使用原代培养的大鼠肝细胞使用DNA微阵列来阐明基因表达的变化，并阐明诱导基因表达的上游因子。在2022年，由于原代培养的大鼠肝细胞的到来延迟，总体上延迟略有延迟，但首先检查了热磷刺激的条件。具体而言，细胞播种条件（细胞密度），磷酸盐浓度（KH2PO4）添加到培养基，刺激时间和细胞回收方法中。使用HEP134-m，来自SD大鼠的初级肝细胞，将24个良好的胶原蛋白涂料板以1.25×10^5和2.5×10^5的密度播种，并在5小时后培养12-24小时。此后，将培养基替换为含磷酸盐的培养基，并随着时间的推移观察到8小时24小时。结果，添加10 mM磷酸盐会导致死细胞，即使在24小时使用3 mm的24小时后也没有观察到明显的异常，并且在2.5 x 10^5下播种时细胞积累的趋势，因此决定以1.25 x 10^5的密度进行实验，并添加3 mm的磷酸盐（磷酸盐浓度为1.25 x 10^5）（磷酸盐浓度为4mm）。此外，使用Isogen II（Nippon基因）收集细胞并制备RNA，因此，产量不足，因此决定从RNeasy微型套件中使用缓冲rlt恢复它，并直接进行柱纯化。从现在开始，将在2022年决定的条件下再次培养并刺激原发性肝细胞，并将使用DNA微阵列分析基因表达变化。