アンジオテンシンIIによる細胞増殖・肥大におけるGRK-5抑制効果の検討

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(1)血管平滑筋細胞におけるホスホリバーゼ活性測定法の確立:ラット大動脈中膜血管平滑筋細胞を継代培養した。(1)ホスホリパーゼC活性:[^3H]イノシトールで標識した培養細胞に100nMアンジオテンシンII(AII)を15秒間投与した。細胞溶解液よりAG-1-X8レジンカラムクロマトグラフィーにて各イノシトールリン酸(IP)分画を溶出、各分画の放射活性を測定した。AII刺激にて細胞内IP_3は250%増加した。(2)ホスホリパーゼD活性:[^3H]パルミチン酸で標識した培養細胞にAIIを15分間投与した。細胞溶解液の脂質相を一次元薄層クロマトグラフィーにて展開しホスファチジルブタノール(PtBu)放射活性を測定した。AII刺激にてPtBu産生量は330%増加した。(2)HVJ-リボゾーム法によるin vitro遺伝子導入:(1)G蛋白質共役型受容体キナーゼ5(GRK5)全長cDNAを発現ベクターpUCにGRK5cDNAを組み込んだ。不活化Hemmagglutinating Virus of Japan(HVJ)と脂質からなるリボゾームにGRK5組み換えpUCを取り込ませHVJ-リポゾーム-cDNA組み換えベクターを作成した。コントロールとしてβ-ガラクトシダーゼ(β Gal)組み換えベクターを作成した。(2)βGal組み換えベクターを含むHVJ-リボゾームを培地に加え培養平滑筋細胞への遺伝子導入を試みた。現在導入効率の改善を検討中である。今後、GRK5組み換えHVJ-リボゾームを用いてGRK5過剰発現細胞を作成し、(1)細胞増殖・肥大に対する影響(2)AII刺激に対するPLC・PLD活性の変化を観察し、GRK5の生理学的意義の検討を行う予定である。