メサンギウム細胞におけるAGE受容体(RAGE)の機能と発現調整の検討

human RAGEはN末が細胞外、C末が細胞内のsingle transmembraneの蛋白質であるが、その細胞内ドメイン由来の15アミノ酸のペプタイドを作製、KLHに結合し、家兎を免疫した。血清の抗ペプタイド活性をBSAにペプタイドを結合しドットプロットにより確認した。一方、human RAGEのgenomic sequenceをもとにプライマーを設計し、human RAGEのcDNAをhuman lung由来のmRNAよりRT-PCRによりクローニングした。ついで、human RAGE cDNAをpcDNAampに組み込み、human RAGEの哺乳類発現ベクター(h-RAGE-pcDNAamp)を作製した。h-RAGE-pcDNAampをリポフェクチンを用いてOKP細胞に導入し、対照のnativeのOKP細胞とともにimmuno blotを行った。上述の抗血清では、h-RAGE導入OKP細胞に約50Kdの新たなバンドが出現した。このバンドはpreimmune血清では認めなかった。さらに、この新たなバンドは免疫に用いたペプタイドでブロックされた。以上より、発現ベクターの機能、ならびに、抗RAGE抗体の存在を確認した。また、アンチセンスRAGE発現ベクターも作製した。BSAをglucoseとincubateし、AGE-BSAを作製、蛍光活性はこれまでの報告と一致した。現在NFKBで活性化されるIL6プロモーターのCATリポータープラスミドとRAGEを共発現し、RAGEの受容体機能を検討中である。

human RAGEはN末が細胞外、C末が細胞内のsingle transmembraneの蛋白質であるが、その細胞内ドメイン由来の15アミノ酸のペプタイドを作製、KLHに結合し、家兎を免疫した。血清の抗ペプタイド活性をBSAにペプタイドを結合しドットプロットにより確認した。一方、human RAGEのgenomic sequenceをもとにプライマーを設計し、human RAGEのcDNAをhuman lung由来のmRNAよりRT-PCRによりクローニングした。ついで、human RAGE cDNAをpcDNAampに組み込み、human RAGEの哺乳類発現ベクター(h-RAGE-pcDNAamp)を作製した。h-RAGE-pcDNAampをリポフェクチンを用いてOKP細胞に導入し、対照のnativeのOKP細胞とともにimmuno blotを行った。上述の抗血清では、h-RAGE導入OKP細胞に約50Kdの新たなバンドが出現した。このバンドはpreimmune血清では認めなかった。さらに、この新たなバンドは免疫に用いたペプタイドでブロックされた。以上より、発現ベクターの機能、ならびに、抗RAGE抗体の存在を確認した。また、アンチセンスRAGE発現ベクターも作製した。BSAをglucoseとincubateし、AGE-BSAを作製、蛍光活性はこれまでの報告と一致した。現在NFKBで活性化されるIL6プロモーターのCATリポータープラスミドとRAGEを共発現し、RAGEの受容体機能を検討中である。