抱合型25-ヒドロキシビタミンD分析法の開発

1.先に合成したビタミンD(D)及び25-ヒドロキシビタミンD[25(OH)D]の抱合体(サルフェート及びグルクロニド)のHPLCにおけるクロマトグラフ的挙動を精査し,D_2,D_3系相互,位置異性体相互が良好に分離する条件を設定した.2.上記の知見を基に,D,25(OH)D及び対応するプロ体のグルクロニドをβ-グルクロニダーゼ水解に付し,残存基質及び成績体をUV検出HPLCにより分析したところ,用いる酵素原により基質特異性が観察された.一方,サルフェートはほとんど酵素水解を受けなかった.3.ヒト血中25(OH)D_3のUV検出HPLCによる定量法を確立した.本法は内標準物質として非放射性物質を用いるもので,従来法に比し汎用性に優れるものであった.本法と先に開発した25(OH)D_3 3-サルフェート(3S)定量法を駆使し,健常人と慢性腎不全患者血中における25(OH)D_3と25(OH)D_33Sの相関を求めたところ,病態との関連を示唆する興味ある知見が得られた.4.D_3又は25(OH)D_3投与後の胆管ろうラット胆汁中に各々のモノグルクロニド[D_33G又は25(OH)D_3-3G,-25G]が存在することを確認した.前処理には逆相系固相抽出カートリッジと疎水性陰イオン交換ゲルを用い,グルクロニドを選択的に抽出した.同定は標品を指標とし,UV,フォトダイオードアレイUV及び誘導体化後の蛍光検出HPLCにより行った.また,2の知見を基に酵素水解し,その抱合形式とともにゲニン部の構造を確認した.特に,立体障害の大きい3級水酸基である25位への抱合が観察されたことは,興味深いものであった.

1.先に合成したビタミンD(D)及び25-ヒドロキシビタミンD[25(OH)D]の抱合体(サルフェート及びグルクロニド)のHPLCにおけるクロマトグラフ的挙動を精査し,D_2,D_3系相互,位置異性体相互が良好に分離する条件を設定した.2.上記の知見を基に,D,25(OH)D及び対応するプロ体のグルクロニドをβ-グルクロニダーゼ水解に付し,残存基質及び成績体をUV検出HPLCにより分析したところ,用いる酵素原により基質特異性が観察された.一方,サルフェートはほとんど酵素水解を受けなかった.3.ヒト血中25(OH)D_3のUV検出HPLCによる定量法を確立した.本法は内標準物質として非放射性物質を用いるもので,従来法に比し汎用性に優れるものであった.本法と先に開発した25(OH)D_3 3-サルフェート(3S)定量法を駆使し,健常人と慢性腎不全患者血中における25(OH)D_3と25(OH)D_33Sの相関を求めたところ,病態との関連を示唆する興味ある知見が得られた.4.D_3又は25(OH)D_3投与後の胆管ろうラット胆汁中に各々のモノグルクロニド[D_33G又は25(OH)D_3-3G,-25G]が存在することを確認した.前処理には逆相系固相抽出カートリッジと疎水性陰イオン交換ゲルを用い,グルクロニドを選択的に抽出した.同定は標品を指標とし,UV,フォトダイオードアレイUV及び誘導体化後の蛍光検出HPLCにより行った.また,2の知見を基に酵素水解し,その抱合形式とともにゲニン部の構造を確認した.特に,立体障害の大きい3級水酸基である25位への抱合が観察されたことは,興味深いものであった.