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有機触媒を利用した生体外タンパク質合成系

使用有机催化剂的体外蛋白质合成系统

基本信息

批准号：
08780538
负责人：
新田至
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質合成はリボソーム上で進行し、リボソームはリボソームタンパク質とrRNAから構成されている。タンパク質合成の活性中心はリボソームタンパク質上に存在していると歴史的には考えられてきたが、現在ではタンパク質合成の活性中心はrRNA上に存在しているのではないかとの考えが支持されつつある。我々が開発したタンパク質合成系は、ピリジンをはじめとする芳香族三級アミンから構成される極めて単純化されたものであり、タンパク質合成活性中心を探査する場合、従来の複雑なタンパク質合成系を研究対象とするより、我々の系を用いるほうが得策である。そこで本研究では、リボソームをrRNAに置き換えたタンパク質合成系を、芳香族三級アミン存在下で構築することにより、タンパク質合成の活性中心はrRNA上に存在していることの証明を目的とした。まず、試験管内転写によるrRNAの大量調製法を以下の手順により確立した。まず、rRNAをコードしている鋳型DNAを、大腸菌ゲノムDNAよりPCR法により増幅した。その際、プライマーにT7RNAポリメラ-セのプロモーターを連結しておいた。次に、鋳型DNAをpUCペクターに導入し、JM109株に形質転換して大量調製後、この鋳型DNAを用いて、T7RNAポリメラーゼによりrRNAを試験管内で大量に合成した。次に、試験管内合成されたrRNAを用いて、ピリジン存在下生体外タンパク質合成系を構築した。この際、特に検討を要したのが、rRNAを活性な高次構造に折りたたむ条件の確立であった。このことは、適当な塩濃度溶液に対して、クル-ドなrRNAを透析することにより達成された。さらに、23SrRNAは重合度2904の巨大な生体高分子であるが、活性に関与しているのはその一部であるとの仮説の基に、以下の手順でrRNAの機能部位を検討する実験的方法を確立した。(a)クロラムフェニコールなどの抗生物質を利用してrRNA上での活性部位を絞り込みを行っている。(b)翻訳因子等が存在しなくとも、tRNAをリボソームに直接結合することが可能である。この手法を用いて、rRNA上のtRNA結合位置を検討している。

In this connection, you need to make sure that you are in progress, and that you need to know that you are in the process. You need to know that you are in the process of rRNA. In the active center of synthesis, there is a study of the history of the synthesis of the active center, the active center of the synthesis, the active center of the rRNA, the active center, the active center. We are responsible for the development of a synthetic system, a system for the synthesis of aromatic compounds, a system for the synthesis of aromatic compounds, an active center for the synthesis of aromatic compounds, an active center for the synthesis of aromatic compounds, and an active center for the synthesis of aromatic compounds. In this study, there are three levels of aromatic compounds in this study, such as the synthesis system, the three-stage aromatic compounds, the active center, the rRNA, the active center, the rRNA. Please write a large number of methods in the tube to ensure the establishment of the rRNA. For example, rRNA, DNA, PCR, PCR, and so on, the size of the frame is different. We need to know if you want to know if you are not T7RNA. After the second and third type DNA