亜鉛プロテイナーゼの基質認識機構に関する構造化学的研究

锌蛋白酶底物识别机制的结构化学研究

• 批准号: 08780568
• 负责人: 山本 雅貴
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780568/
• 关键词: プロテアーゼ; 基質認識; 結晶構造解析

ハブ毒由来のプロテイナーゼであるH_2-Protenaseについて基質認識機構を明らかにするため,以下のような実験を行った.本酵素の酵素反応速度の研究において使われた合成基質や阻害作用を持つペプチドの配列を元に複数の合成ペプチドを作成した.これらと酵素の複合体結晶を得るため改めて結晶化条件の検索を行ったが,Thr-Glu-Lys-Leu-Val(P-S1)については,透析法によって活性金属イオンの置き換えを行った酵素と共結晶化を行った結果,単体の場合とほぼ同じ条件で結晶が析出した.得られた結晶は,単体のそれとは異なる結晶系に属しており,空間群P4_332,a=117.6Åであった.データ収集は実験室で行い,2.2Å分解能までの反射に対して完全性97.1%,信頼度因子8.67%で得ることができた.構造解析は単体分子の構造を元にした分子置換法によって行い,現在,分子モデルを信頼度因子19.0%で得ている.得られた電子密度図には酵素の活性中心である亜鉛の近傍に余剰の電子密度が見られた.その大きさは2残基程度であり酵素の基質特異性等からP-S1のうちのLeu-Valであると判断された.この結果から,酵素のクレフトの両エッジを走るβ鎖と基質の主鎖の間のβシートライクな相互作用と,酵素のS1疎水ポケットによる基質側鎖の認識P1-P2サイトでの基質認識の主な構成要素であることが理解された.また,この構造では添加したニッケルイオンが活性中心とは異なる位置にも見られ,酵素のHis側鎖とペプチドを配位するように結晶学的二回軸上に存在していた.この結晶では,単体のそれと比べてX線照射耐性が向上したうえ,全原子平均の温度因子が低下した.二価イオンやペプチドの添加がよりよい結晶を得るのに効果がある一例を示したといえる.

H_2-Protease is the key to understanding the origin of the virus. Study on the reaction rate of this enzyme in order to prevent the synthesis of substrate inhibition, maintain the selection of the ligand, and make a plurality of synthesis of the substrate. Crystallization of enzyme complexes was carried out under the same conditions as in the case of single crystals, Thr-Glu-Lys-Leu-Val(P-S1), dialysis, and enzyme co-crystallization. The crystal system belongs to space group P4_332,a=117.6 The resolution energy of the reflection is 97.1% and the reliability factor is 8.67%. Structure analysis of single molecule structure element was carried out by molecular substitution method, and now molecular structure element reliability factor of 19.0% was obtained. The electron density of the active center of the enzyme is higher than that of the active center. P-S1 and Leu-Val are the two residue levels of the enzyme. As a result, the interaction between β-lock and matrix lock of enzyme S1 and matrix lock of enzyme P1-P2 is understood. The structure of the enzyme is characterized by the presence of active centers in different positions, and the presence of enzymes in the two axes of crystallography. The crystallization of these crystals is more resistant to X-ray irradiation than the single crystals, and the temperature factor of the all-atomic average is lower. Two examples of crystal growth are given.