アミノ酸誘導体を基質とする光学分割酵素の光学異性認識に関する基礎的研究

以氨基酸衍生物为底物的光学拆分酶光学异构体识别基础研究

• 批准号: 09760095
• 负责人: 若山 守
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Oita University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760095/
• 关键词: Alcaligenes; N-アシル-D-アミノ酸アミドヒドロラーゼ; 化学修飾; 部位特異的変異導入; 活性中心残基; ヒスチジン残基; アルギニン残基; Pseudomonas maltophila; N-アシル-L-アミノ酸アミドヒドロラーゼ; L-α-アミノスベリン酸; D-アミノアシラーゼ

Alcaligenes属細菌A-6株が誘導生産する基質特異性が厳密に異なる3種類のN-アシル-D-アミノ酸アミドヒドロラーゼ、すなわち、D-アミノアシラーゼ、N-アシル-D-アスパラギン酸アミドヒドロラーゼおよびN-アシル-D-グルタミン酸アミドヒドロラーゼの構造と機能に関して、特にその光学異性認識に関わるアミノ酸残基を探索するため、まずは、活性中心を構成するアミノ酸残基の検索を行なった。化学修飾実験の結果から、3種類の酵素はすべて、ジエチルピロカーボネート(DEPC)およびフェニルグリオキサール(PGO)により濃度および時間依存的に失活することから、ヒスチジンとアルギニンがそれぞれ活性発現に深く関与している、すなわち、活性中心に位置するアミノ酸残基であると考えられた。そこで、3つの酵素間で保存されている8つのヒスチジン、12個のアルギニン残基をアスパラギンあるいはイソロイシンに置換した変異酵素を作成して大腸菌において発現させた。各種変異酵素を精製して速度論的諸性質を調べたところ、各酵素間で保存されているAsp-X_1-His-X_2-His-ASp-ASpのうち、前半のHisは触媒に直接関与するアミノ酸残基であり、後半のHisは構造の維持あるいは形成に関与し、必須因子であるZn保持のリガンドしての役割を担っている可能性が示された。また、アルギニン残基については、D-アミノアシラーゼにおいて、296、302、377番目のアルギニンが構造形成あるいは維持に重要な役割を果たしている残基であることが明らかとなった。現在、D-アミノアシラーゼのX-線結晶解析のための結晶化を行なっている。

In order to search for the structure and functions of three types of N-acyl-D-amino acid amide hydrolases with strictly different substrate specificity produced by Alcaligenes bacteria strain A-6, namely D-aminoacylase, N-acyl-D-aspartate amide hydrolases and N-acyl-D-glutamic amide hydrolases, in particular, amino acid residues involved in their optical isomerism recognition, we first搜索构成活性中心的氨基酸残基。从化学修饰实验的结果中，所有三种酶都以浓度和时间依赖性方式通过二乙基碳酸盐盐（DEPC）（DEPC）和苯基乙二醇（PGO）取代，因此人们认为组氨酸和精氨酸被认为与活性中心的氨基酸残基深深涉及活性表达。因此，创建了一种突变酶，其中三种酶之间保守的八个组氨酸和12个精氨酸残基被天冬酸酯或异亮氨酸取代，并在大肠杆菌中表达。当纯化各种突变酶并研究了动力学特性时，显示出酶之间保守的ASP-X_1-HIS-X_2-HIS-ASP-ASP在酶之间保守的，他的上半年是直接参与催化剂中的氨基酸残基，下半年在下半年中涉及该结构的维护或结构，可能会扮演Zn的角色，并且可以扮演Z的角色。此外，关于精氨酸残基，已经揭示了在D-氨基酰基酶的位置296、302和377处的精氨酸，精氨酸在296、302和377的位置在结构的形成或维持中起重要作用。目前，D-氨基酰基酶结晶用于X射线晶体学。

项目成果

若山守,椎葉英一 酒井謙二,森口充瞭: "Purification and Characterization of L-Aminoaiylase from Pseudomous maltophila Bl" Journal of Fermentation and Bioengineering. 85巻・3号. 278-282 (1998)

Mamoru Wakayama、Eiichi Shiiba、Kenji Sakai、Mitsuhiro Moriguchi：“Pseudomous maltophila Bl 的 L-氨基酰化酶的纯化和表征”《发酵与生物工程杂志》85，第 3 期。278-282（1998 年）。

若山 守,椎葉英一,酒井謙二,森口充瞭: "Purification and Characterization of L-Aminoacylase from Pseudomonas maltophilaB1" Journal of Fermentation and Bioengineering. 85巻・3号. 278-282 (1998)

Mamoru Wakayama、Eiichi Shiiba、Kenji Sakai、Mitsuhiro Moriguchi：“来自嗜麦芽假单胞菌 B1 的 L-氨基酰化酶的纯化和表征”《发酵与生物工程杂志》，第 85 期，第 3 期，第 278-282 期（1998 年）。