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新しいヒトG-蛋白質共役受容体EDGファミリーのリガンド決定と生理機能の解析(Biopanning法による未知のレセプターのリガンド決定法の確立)

新型人G蛋白偶联受体EDG家族的配体测定及生理功能分析（利用生物淘选法建立未知受体的配体测定方法）

基本信息

批准号：
09770026
负责人：
山口文徳
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kagawa Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

Biopanning法を応用したG蛋白共役レセプターのリガンド確定法のコントロールとして既存のアンギオテンシンレセプターのcDNA配列をデータベースから得て、PCRにて coding regionを増幅し、蛋白発現ベクターに組み込んだ。このベクターを使ってほ乳類培養細胞でアンギオテンシンレセプター蛋白を大量に発現させた。蛋白発現の際に蛋白の末端に6個のアミノ酸からなるヒスチジンタグを付け、発現したアンギオテンシンレセプターのみを選択的に回収できるようにした。次にこのアシギオテンシンレセプター蛋白とランダムなペプチドを発現しているファージライブラリーを混合してアシギオテンシンレセプターに親和性をもつペプチド配列を発現するファージを結合させた。レセプター・ファージ複合体はヒスチジンタグと特異的に結合するニッケルイオンでコートされたマイクロタイターウエル上に捕獲され、関係のないファージは数回の洗浄で取り除かれた。最後にこの特異的に結合したファージを洗い出し、回収後にその塩基配列を決定することでアンギオテンシンレセプターに結合するペプチド配列を得た。このサイクルを数回くりかえすことでより正確なペプチド配列を得ることができた。この方法は既存のレセプターのみではなく、今までにそのリガンドが知られていない未知のペプチドレセプターに対しても応用できることが考えられる。また既存のレセプターに対しても今までに知られていない特異的に結合する新しいペプチド配列の探索も可能である。

Biopanning method is used to determine the cDNA sequence of G protein co-active protein sequence, PCR coding region and protein expression sequence. The protein is produced in large quantities by the culture of milk cells. At the time of protein development, six terminal amino acids were found in the protein. In the second place, the selection process of the selected candidate is realized in the first place, and the selection process of the selected candidate is realized in the second place. The complex is composed of two parts: one part is the first part, the other part is the second part, the other part is the third part, the other part is the third part, the fourth part is the third part, the fourth part is the fourth part is the fourth part, the fourth part is the fourth part, the fourth part is the fourth part Finally, the combination of the two elements is determined. The number of times the number of times This method is based on the existing and unknown selection criteria. There are already some problems with this system, but it is possible to find new ways to combine them.