cDNAカセットを用いた変異体作製法によるリアノジン受容体の機能領域の検索

昨年度の実験で作製した「カセット構造化」したリアノジン受容体(RyR1)cDNAの1番、4番、11番に緑色蛍光蛋白質(GFP)のcDNAを連結して、RyR1のGFP融合蛋白質をコードするcDNA(4種類)を作製し、培養細胞(HEK293、CHO)に強制発現させた。その結果、RyR1のアミノ基(N)末端、カルボキシル基(C)末端(C末端より14アミノ酸削除したものとC末端完全長のもの)、及びD2領域(N末端より1397番目のアミノ酸位)にGFPを融合させた蛋白質が、生きたままの細胞で細胞質に点在するRyR1の分布が可視化・定量化できるようになり、個々の細胞で分布/発現量に顕著な差異があることが判った。更に、RyR1作用薬である4-chioro-3-ethylphenol(4-CEP)によるCa^<2+>放出能の有無を調べたところ、4種類のGFP融合RyR1蛋白質の内、D2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させた細胞だけが4-CEPによるCa^<2+>放出機能を保持していたので、このD2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させる実験方法を用いれば、GFP蛍光による詳細なRyR1の細胞内分布と発現量の解析ができ、同時に細胞内Ca^<2+>シグナルの空間・時間的な変化の関係を調べることも可能であるが判った。逆に、RyR1のC末端、N末端にGFPを融合させた蛋白質を発現させた細胞では4-CEPによるCa^<2+>放出能が損失、もしくは強く抑えられていたので、RyR1の両端(特にC末端)がCa^<2+>放出能に重要な領域であることが判った。

昨年度の実験で作製した「カセット構造化」したリアノジン受容体(RyR1)cDNAの1番、4番、11番に緑色蛍光蛋白質(GFP)のcDNAを連結して、RyR1のGFP融合蛋白質をコードするcDNA(4種類)を作製し、培養細胞(HEK293、CHO)に強制発現させた。その結果、RyR1のアミノ基(N)末端、カルボキシル基(C)末端(C末端より14アミノ酸削除したものとC末端完全長のもの)、及びD2領域(N末端より1397番目のアミノ酸位)にGFPを融合させた蛋白質が、生きたままの細胞で細胞質に点在するRyR1の分布が可視化・定量化できるようになり、個々の細胞で分布/発現量に顕著な差異があることが判った。更に、RyR1作用薬である4-chioro-3-ethylphenol(4-CEP)によるCa^<2+>放出能の有無を調べたところ、4種類のGFP融合RyR1蛋白質の内、D2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させた細胞だけが4-CEPによるCa^<2+>放出機能を保持していたので、このD2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させる実験方法を用いれば、GFP蛍光による詳細なRyR1の細胞内分布と発現量の解析ができ、同時に細胞内Ca^<2+>シグナルの空間・時間的な変化の関係を調べることも可能であるが判った。逆に、RyR1のC末端、N末端にGFPを融合させた蛋白質を発現させた細胞では4-CEPによるCa^<2+>放出能が損失、もしくは強く抑えられていたので、RyR1の両端(特にC末端)がCa^<2+>放出能に重要な領域であることが判った。