cDNAカセットを用いた変異体作製法によるリアノジン受容体の機能領域の検索

通过使用 cDNA 盒创建突变体来搜索兰尼碱受体的功能区域

• 批准号: 09770067
• 负责人: 小山田 英人
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770067/
• 关键词: リアノジン受容体; カルシウムイオン; 分子生物学

昨年度の実験で作製した「カセット構造化」したリアノジン受容体(RyR1)cDNAの1番、4番、11番に緑色蛍光蛋白質(GFP)のcDNAを連結して、RyR1のGFP融合蛋白質をコードするcDNA(4種類)を作製し、培養細胞(HEK293、CHO)に強制発現させた。その結果、RyR1のアミノ基(N)末端、カルボキシル基(C)末端(C末端より14アミノ酸削除したものとC末端完全長のもの)、及びD2領域(N末端より1397番目のアミノ酸位)にGFPを融合させた蛋白質が、生きたままの細胞で細胞質に点在するRyR1の分布が可視化・定量化できるようになり、個々の細胞で分布/発現量に顕著な差異があることが判った。更に、RyR1作用薬である4-chioro-3-ethylphenol(4-CEP)によるCa^<2+>放出能の有無を調べたところ、4種類のGFP融合RyR1蛋白質の内、D2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させた細胞だけが4-CEPによるCa^<2+>放出機能を保持していたので、このD2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させる実験方法を用いれば、GFP蛍光による詳細なRyR1の細胞内分布と発現量の解析ができ、同時に細胞内Ca^<2+>シグナルの空間・時間的な変化の関係を調べることも可能であるが判った。逆に、RyR1のC末端、N末端にGFPを融合させた蛋白質を発現させた細胞では4-CEPによるCa^<2+>放出能が損失、もしくは強く抑えられていたので、RyR1の両端(特にC末端)がCa^<2+>放出能に重要な領域であることが判った。

In the past year, the cDNA of green fluorescent protein (GFP) was linked to the cDNA of RyR1 at 1, 4 and 11 positions, and the cDNA of GFP fusion protein of RyR1 (4 species) was produced under stress in cultured cells (HEK293 and CHO). Results, RyR1 N-terminal group, RyR1 N-terminal group, RyR1 C-terminal group The distribution of RyR1 in the cytoplasm of the cells was visualized and quantified. The distribution of RyR1 in the cytoplasm of the cells was determined by the difference between the protein and protein fusion in the C-terminal region (C-terminal region 14-acid deletion) and the D2 region (N-terminal region 1397-acid deletion). In addition, RyR1 function is regulated by the presence or absence of Ca^<2+> emission in the 4-chioro-3-ethylphenol(4-CEP) domain. Four kinds of GFP fusion RyR1 protein in the inner half of the D2 domain GFP fusion RyR1 expression in the cell 4-CEP Ca^<2+> emission function is maintained in the middle of the D2 domain GFP fusion RyR1 expression in the cell 4-CEP Ca^<2+> emission function in the middle of the D2 domain GFP fusion RyR1 expression in the cell 4-CEP Ca^<2+> emission function is maintained in the middle of the D2 domain GFP fusion RyR1 expression in the D2 domain. The cellular distribution and expression of RyR1 in GFP fluorescence were analyzed in detail, and the spatial and temporal relationship between intracellular Ca^<2+> and RyR1 was modulated. In reverse, RyR1 C-terminal and N-terminal GFP fusion proteins are found in cells with 4-CEP, Ca^<2+> emission energy loss, Ca^<2+> emission energy suppression, and Ca^<2+> emission energy at RyR1 C-terminal (especially at C-terminal).

项目成果

辻まゆみ: "The expression of calcium channel in cholestatic-hepatocytes from bile duct ligated-rat." The Japanese Journal of Pharmacology. 76. 266 (1998)

Mayumi Tsuji：“结扎胆管的大鼠胆汁淤积性肝细胞中钙通道的表达”，《日本药理学杂志》76. 266 (1998)。

若槻一直: "Visualization of ryanodine receptor fused with green fluorescent protein in living cells." The Japanese Journal of Pharmacology. 76. 236 (1998)

Kazunao Wakatsuki：“活细胞中与绿色荧光蛋白融合的兰尼碱受体的可视化。”日本药理学杂志 76. 236 (1998)

小山田英人: "リアノジン受容体cDNAのカセット構造化" 日本薬理学雑誌. 110・4. 74 (1997)

小山田秀人：“兰尼碱受体 cDNA 的盒式结构”日本药理学杂志 110, 4. 74 (1997)。

村山尚: "Further characterization of the type 3 ryanodine receptor (RyR3) purified from rabbit diaphargm." The Journal of Biological Chemistry. (印刷中). (1999)

Takashi Murayama：“从兔隔膜中纯化的 3 型兰尼碱受体 (RyR3) 的进一步表征。”《生物化学杂志》（1999 年出版）。

若槻一直: "可視化カルシウム放出チャンネルの機能的な発現" 日本薬理学雑誌. 113・2. 30 (1999)

Kazunao Wakatsuki：“可视化钙释放通道的功能表达”日本药理学杂志 113・2.30（1999）。