ブタ幼若エナメル質に含まれるシアリダーゼの精製とシアリル糖鎖の機能について

仔猪牙釉质唾液酸酶的纯化及唾液酸糖链的功能

基本信息

批准号：
09771556
负责人：
山越康雄
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tsurumi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

1. ザイモグラフィーによるエナメルシアリダーゼの検出幼若エナメル質からリン酸緩衝液(pH7.4)抽出にて得られた粗酵素試料を用いてムチンを基質としたザイモグラフィーを行った結果、分子量約24,000付近に活性バンドが認められた。さらにプロテアーゼと区別するために、プロアーゼ阻害剤及びシアリダーゼ阻害剤を用いて同様の実験を行った結果、シアリダーゼ阻害剤である過マンガン酸カリウム、硫酸銅、DDNを含んだそれぞれの緩衝液に反応させると、活性バンドが消失したことより、この24kDaの活性バンドがシアリダーゼであることが示唆された。2. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるシアリダーゼの同定実験32kDaエナメリンからN型糖鎖を酵素的に遊離させ、2-ピリジルアミンで蛍光標識した、PA化糖鎖を用いて、上記粗酵素試料と反応させて、反応前後での逆相HPLCの溶出パターンを比較した結果、モノシアロ糖鎖からアシアロ糖鎖への変化が認められたことより、シアリダーゼの存在が確認された。また、この実験では、α2-6結合よりもα2-3結合でガラクトースに結合しているシアル酸の方が、より早く遊離することもわかった。今後、エナメルシアリダーゼの性質及び32kDaエナメリンの前駆体である89kDaエナメリンに対する作用についても検討しなければならないが、今回の実験により、幼若エナメル質中に含まれるシアリダーゼが量的にかなり少ないことと約15日で失活することも判明したので、これらの点もふまえた実験条件や操作方法の改良が必要とされる。

1。通过Zymography检测搪瓷盐酸酶。通过磷酸盐缓冲液（pH 7.4）提取幼年搪瓷获得的粗酶样品，使用粘蛋白作为底物进行Zymography，并以约24,000的分子量发现活性带。此外，为了区分蛋白酶，使用促酶抑制剂和唾液酸酶抑制剂进行了类似的实验，当活性带消失时，当含有高锰钾，硫酸铜和DDN时，活性带消失了，它们是唾液酸酶抑制剂，这是活跃的带消失的，表明这24KDA活性带是sialidase sialidasialidase sialidsialidasialidasialidsialidsialidiDIDASE。 2。通过高性能液相色谱（HPLC）鉴定N型糖链从32KDA搪瓷蛋白释放，而PA-Type糖链则在2-吡啶基胺和2-吡啶基胺和后期的HPLC荧光标记之前和后期的HPLC荧光标记。结果，观察到了从单糖基化链化链的变化，从而证实了唾液酸的存在。该实验还表明，与α2-3键的半乳糖结合的唾液酸比在α2-6键上更快。将来，我们还必须考虑搪瓷唾液酸酶的特性及其对89 kDa搪瓷的作用，这是32 kDa搪瓷蛋白的前体，但是该实验还表明，幼年搪瓷中包含的唾液酸酶量很小，可以在15天内划分，因此可以将其划分为必要的情况，并将其提高到实验中。