ブタ幼若エナメル質に含まれるシアリダーゼの精製とシアリル糖鎖の機能について

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1. ザイモグラフィーによるエナメルシアリダーゼの検出幼若エナメル質からリン酸緩衝液(pH7.4)抽出にて得られた粗酵素試料を用いてムチンを基質としたザイモグラフィーを行った結果、分子量約24,000付近に活性バンドが認められた。さらにプロテアーゼと区別するために、プロアーゼ阻害剤及びシアリダーゼ阻害剤を用いて同様の実験を行った結果、シアリダーゼ阻害剤である過マンガン酸カリウム、硫酸銅、DDNを含んだそれぞれの緩衝液に反応させると、活性バンドが消失したことより、この24kDaの活性バンドがシアリダーゼであることが示唆された。2. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるシアリダーゼの同定実験32kDaエナメリンからN型糖鎖を酵素的に遊離させ、2-ピリジルアミンで蛍光標識した、PA化糖鎖を用いて、上記粗酵素試料と反応させて、反応前後での逆相HPLCの溶出パターンを比較した結果、モノシアロ糖鎖からアシアロ糖鎖への変化が認められたことより、シアリダーゼの存在が確認された。また、この実験では、α2-6結合よりもα2-3結合でガラクトースに結合しているシアル酸の方が、より早く遊離することもわかった。今後、エナメルシアリダーゼの性質及び32kDaエナメリンの前駆体である89kDaエナメリンに対する作用についても検討しなければならないが、今回の実験により、幼若エナメル質中に含まれるシアリダーゼが量的にかなり少ないことと約15日で失活することも判明したので、これらの点もふまえた実験条件や操作方法の改良が必要とされる。