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ブタ幼若エナメル質に含まれるシアリダーゼの精製とシアリル糖鎖の機能について

仔猪牙釉质唾液酸酶的纯化及唾液酸糖链的功能

基本信息

批准号：
09771556
负责人：
山越康雄
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tsurumi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

1. ザイモグラフィーによるエナメルシアリダーゼの検出幼若エナメル質からリン酸緩衝液(pH7.4)抽出にて得られた粗酵素試料を用いてムチンを基質としたザイモグラフィーを行った結果、分子量約24,000付近に活性バンドが認められた。さらにプロテアーゼと区別するために、プロアーゼ阻害剤及びシアリダーゼ阻害剤を用いて同様の実験を行った結果、シアリダーゼ阻害剤である過マンガン酸カリウム、硫酸銅、DDNを含んだそれぞれの緩衝液に反応させると、活性バンドが消失したことより、この24kDaの活性バンドがシアリダーゼであることが示唆された。2. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるシアリダーゼの同定実験32kDaエナメリンからN型糖鎖を酵素的に遊離させ、2-ピリジルアミンで蛍光標識した、PA化糖鎖を用いて、上記粗酵素試料と反応させて、反応前後での逆相HPLCの溶出パターンを比較した結果、モノシアロ糖鎖からアシアロ糖鎖への変化が認められたことより、シアリダーゼの存在が確認された。また、この実験では、α2-6結合よりもα2-3結合でガラクトースに結合しているシアル酸の方が、より早く遊離することもわかった。今後、エナメルシアリダーゼの性質及び32kDaエナメリンの前駆体である89kDaエナメリンに対する作用についても検討しなければならないが、今回の実験により、幼若エナメル質中に含まれるシアリダーゼが量的にかなり少ないことと約15日で失活することも判明したので、これらの点もふまえた実験条件や操作方法の改良が必要とされる。

1. The crude enzyme sample was extracted from an acid buffer solution (pH 7.4) and its molecular weight was about 24,000. In addition to the above, it is also possible to use the same inhibitor as the inhibitor in the buffer solution. 2. High speed liquid chromatography (HPLC) is used to compare the dissolution of N-type glycoenzyme with that of crude enzyme sample and reverse phase HPLC before and after reverse phase chromatography. The results show that the dissolution of N-type glycoenzyme is identified by HPLC before and after reverse phase chromatography The existence of the missing piece is confirmed. 2 - 6 binding, α2-3 binding, α2-6 binding, α 2 binding, α 2 - 6 binding, α 2 - 6 binding, α 2 binding, αIn the future, the nature of the protein and the role of the precursor of the protein with a molecular weight of about 32kDa will be discussed. It is necessary to improve the operation method of the system.