cyclic ADP-ribose合成・分解酵素の基質と調節因子の結合部位の決定

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cyclic ADP-ribose(cADPR)は申請者らがインスリン分泌のセンカンドメッセンジャーとして新しく見出した細胞内情報伝達物質である。申請者らはまた、cADPRの合成・分解酵素の実体はCD38であり、CD38のcADPR分解酵素活性はATPによって抑制されることを明らかにしている。従って、cADPR合成・分解の調節機構を分子レベルで理解するためには、cADPR合成・分解酵素の基質(NAD、cADPR)と調節因子(ATP)の結合部位を同定することが重要であると考えられる。平成10年度の研究は当初計画どおり進行し、以下のような成果が得られた。平成9年度にはNAD、cADPR、ATPに共通するadenosine部分の類似体である5'-p-fluorosufonyl-benzoyladenosine(FSBA)で標識したCD38のエンドペプチダーゼ消化断片から、FSBA-ペプチド断片を同定した。そこで、1.同定したペプチド断片のアミノ酸配列をペプチド-クエンサーを用いて決定したところ、CD38の129番目のリジン(Lys129)がFSBA結合部位であることが明らかとなった。2.Lys129をアラニンまたはアルギニンに変異させたCD38を精製した。抗FSBA抗体を用いたウェスタン法の結果、これらの変異CD38はFSBAと結合しないことが明らかとなった。3.ゲル濾過カラムを用いてCD38のcADPRとの結合活性の検討を行ったところ、これらの変異CD38はcADPRと結合しないことが明らかとなった。4.酵素学的な検討を行なったところ、これら変異型CD38はcADPR分解活性を消失したが、NADを基質とするcADPR合成活性は保持されていた。従って、Lys129がcADPRとATPの共通の結合部位であることから、ATPがLys129でcADPRと競合的に作用することによりCD38のcADPR分解活性を抑制すると考えられた。