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一分子転写運動の抑制機構の解明

阐明单分子转录运动的抑制机制

基本信息

批准号：
10780367
负责人：
加畑博幸
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

T7RNAポリメラーゼがDNA鎖に沿ってRNA鎖を合成するときの転写運動を同定するため、T7RNAポリメラーゼ分子を蛍光顕微鏡下で可視化した。可視化には、ポリメラーゼ1分子に100分子の蛍光色素が導入される必要がある。そこで、ストレプトアビジン蛋白質を蛍光色素TRITCで修飾して蛍光タグとし、これをあらかじめポリメラーゼに導入したビオチン残基と結合させることでポリメラーゼ分子を蛍光修飾する方法を開発した。この蛍光タグは、硫安分画法を用いることで未修飾のTRITC分子や可視化に不充分な数のTRITCで修飾されたアビジンとは別の画分に精製され、タグ1分子にTRITCが100分子以上結合していることを分光法により確認した。この蛍光タグを修飾したT7RNAポリメラーゼの溶液をスライドグラスに滴下して観察したところ、溶液中で明るい光点として検出された。ポリメラーゼの運動がDNA上で生じていること証明するためには、DNAを蛍光色素Yo-Proにより可視化しなければならない。そこで、Yo-Proがポリメラーゼの転写活性に与える影響を調べるため、Yo-Pro存在下および非存在下でのRNA合成産物の量をオートラジオグラフィーにより比較した。大過剰のYo-Pro存在下では非存在下にくらべ転写産物の量が二分の一に減少したが、DNAの検出に十分な濃度のYo-Pro存在下では転写産物の量に変化は見られなかった。このことから、ポリメラーゼとDNAの2重染色を行なった状態での転写運動の顕微鏡観察が可能であることを見出した。現在までに、転写運動の初期段階であるバイナリーコンプレックスの形成の可視化に成功している。

T7RNA molecules can be visualized under a microscope. 1 molecule, 100 molecules and pigment are necessary for visualization. A new method of photo-modification of protein is developed. This is the first time that the TRITC molecule has been modified, and the TRITC molecule has not been fully visualized. The TRITC molecule has been modified, and the TRITC molecule has been refined, and the TRITC molecule has been combined with more than 100 molecules. T7RNA is a light source in the solution. The movement of DNA is demonstrated by the visualization of DNA photochrome Yo-Pro. Yo-Pro is the most important factor affecting RNA synthesis. In the presence or absence of Yo-Pro, the amount of DNA produced decreased by half, and in the presence or absence of Yo-Pro, the amount of DNA produced decreased by half. This is the first time that the DNA has been stained twice. Now, the initial stage of the writing movement is successfully visualized.