植物における亜硝酸をアンモニアに還元する新規酵素遺伝子の解析に関する研究

植物中亚硝酸盐还原为氨的新型酶基因分析研究

• 批准号: 11740446
• 负责人: 高橋 美佐
• 金额: $ 0.45万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11740446/
• 关键词: 亜硝酸還元酵素; トランスジェニック植物; タバコ植物; 硝酸還元; 窒素代謝; トランスジェニックタバコ

亜硝酸還元酵素(NiR)は亜硝酸イオンをアンモニアに六電子還元する酵素で、植物が窒素源として取り込んだ硝酸イオンをアミノ酸にまで還元同化するのに必須の酵素の一つである。NiR cDNAのアンチセンス鎖を導入してNiR酵素活性を野生株の約5%にまで抑制したトランスジェニックタバコクローン271について硝酸還元能を^<15>Nを用いて調査した。亜硝酸還元能の測定はケールダール法により還元態窒素量を、同位体質量分析計により還元態窒素中に含まれる安定同位体比を測定し、両者の値から算出した。その結果、クローン271には野生株とほぼ同レベルの硝酸還元能が有ることが明らかになった。そこで、本研究ではクローン271において観察された硝酸還元能は何によるものなのか、すなわち、NiRとは異なる亜硝酸を還元する新規酵素を明らかにすることを目的として研究を行った。まず、葉および根についてNiR活性の測定を行った。クローン271の葉では野生株の葉で観察されるNiRの5%以下に減少していたが、クローン271の根では野生株の根で観察されるNiR活性とほぼ同レベルの活性値が観察された。そこで、硝酸還元能の測定を切り取り葉を用いて行った。約9週間生育させたクローン271および野生株から切り取った葉を1mM、20mM 50mM K15NO3溶液に浸して8時間おいた後、葉を洗浄、凍結乾燥、粉砕した後、硝酸還元能を測定した。その結果、切り取り用においてもクローン271において野生株とほぼ同レベルの硝酸還元能が観察された。次に、NiR以外に亜硝酸を還元する酵素が存在するか否かを検証するために、クローン271および野生株から抽出した粗抽出液をNativeゲルを用いた二次元電気泳動により分離、NiRの活性染色を行った。その結果、野生株では高い活性を持った2つのスポットと弱い活性を持った2つ以上のスポットが観察されたが、クローン271では活性が弱いスポットのみが観察された。現在これらのスポットのアミノ酸配列を解析中である。

亜 nitrate also yuan enzyme (NiR) は 亜 nitrate イ オ ン を ア ン モ ニ ア に six electronic yuan still す で る enzyme, plant が smothering element source と し て in り 込 ん だ nitrate イ オ ン を ア ミ ノ acid に ま で also yuan assimilation す る の に must の enzyme の つ で あ る. NiR cDNA の ア ン チ セ ン ス lock を import し て NiR enzyme activity を wild strains about 5% に の ま で inhibit し た ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク タ バ コ ク ロ ー ン 271 に つ い て nitric acid can also yuan を ^ < 15 > N を with い て survey し た. 亜 determination of nitric acid can also yuan の は ケ ー ル ダ ー ル method に よ り yuan を smothering element quantity, also with a quality analysis meter に よ り smothering yuan states also contains に in ま れ る determination of stable isotopic body than を し, struck の numerical か ら calculate し た. そ の results, ク ロ ー ン 271 に は wild strains と ほ ぼ with レ ベ ル の nitrate there yuan can が る こ と が Ming ら か に な っ た. そ こ で, this study で は ク ロ ー ン 271 に お い て 観 examine さ れ た nitric acid can also yuan は what に よ る も の な の か, す な わ ち, NiR と は different な る 亜 nitrate を also yuan す る new rules enzyme を Ming ら か に す る こ と を purpose と し を line っ て research た. The NiR activity of まず, および of leaves and および of roots is determined by を rows and った. ク ロ ー ン 271 の leaf で は wild strains の leaf で 観 examine さ れ る NiR の below 5% に reduce し て い た が, ク ロ ー ン 271 の root で は wild strains の root で 観 examine さ れ る NiR active と ほ ぼ with レ ベ ル の active numerical が 観 examine さ れ た. Youdaoplaceholder0 を で で, nitrate reductive energy <s:1> determination を cut take leaves を use そ て to った. About 9 weeks between birth さ せ た ク ロ ー ン 271 お よ び wild strains か ら cut り take っ た leaf を 1 mm and 20 mm to 50 mm に K15NO3 solution leaching し て 8 time お い た incorporated, leaf を, freeze drying, after powder 砕 し た after, determination of nitric acid can also yuan を し た. そ の results, cutting り take り に お い て も ク ロ ー ン 271 に お い て wild strains と ほ ぼ with レ ベ ル の nitric acid can also yuan が 観 examine さ れ た. Outside に, NiR に 亜 nitrate を also yuan す る enzyme が exist す る か no か を 検 card す る た め に, ク ロ ー ン 271 お よ び wild strains か ら spare し た crude extract を Native ゲ ル を with い た secondary yuan electric 気 swimming に よ り separation, NiR の line reactive dyeing を っ た. そ の results, wild strains で は high い activity を hold っ た 2 つ の ス ポ ッ ト と weakly い を hold っ た above 2 つ の ス ポ ッ ト が 観 examine さ れ た が, ク ロ ー ン 271 で は active が weak い ス ポ ッ ト の み が 観 examine さ れ た. Now in the である れら スポット スポット ア ア ノ ノ acid arrangement を analysis である.

项目成果

Goslirma,N.: "Emission of nitrous oxide(N_2O) from transgenic tobacco expressing antisense NiR mRNA"The Plant Journal. 19(1). 75-80 (1999)

Goslirma,N.：“表达反义 NiR mRNA 的转基因烟草释放一氧化二氮 (N_2O)”植物杂志。

M.Takahashi: "Nitrite reductase gene enrichment improves assimilation of nitrogen dioxide in Arabidopsis."Plant Physiology. (In press). (2001)

M.Takahashi：“亚硝酸还原酶基因富集改善了拟南芥中二氧化氮的同化。”植物生理学。

森川弘道: "環境汚染を食べる植物によるファイトレメディエーション"環境科学会誌. 12(4). 421-432 (1999)

Hiromichi Morikawa：“植物修复环境污染”，环境科学学会杂志 12(4) (1999)。

K.Shimizu: "Presence of an SAR-like sequence in junction regions between an introduced transgene and genomic DNA of cultured tobacco cells : its effect on transformation frequency."Plant Journal. (In press). (2001)

K.Shimizu：“在引入的转基因和培养烟草细胞的基因组 DNA 之间的连接区域中存在类似 SAR 的序列：其对转化频率的影响。”《植物杂志》。

H.Morikawa: ""Phytoremediation : Transformation and Control of Contaminants""S.C.McCutcheon and J.L.Schnoor.

H.Morikawa：“植物修复：污染物的转化和控制”S.C.McCutcheon 和 J.L.Schnoor。