黒麹菌グルコアミラーゼのO型糖鎖結合ドメイン改変による酵素機能及び分泌能への影響

米曲霉葡糖淀粉酶O-聚糖结合域修饰对酶功能和分泌能力的影响

• 批准号: 11760071
• 负责人: 後藤 正利
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11760071/
• 关键词: 麹菌; マンノシルトランスフェラーゼ; グルコアミラーゼ; 糖鎖工学; Aspergillus; O-glycosylation; glucoamylase; mannosyltransferase

黒麹菌Aspergillus aw am ori var.kaw achiが分泌するグルコアミラーゼ(GAI)のGp-I領域結合O-型糖鎖は主に1〜3残基のマンノースからなり、酵素活性や酵素の安定化に関与する。本研究はタンパク質分泌能の優れた麹菌を宿主として、O-型糖鎖を改変したGAIの発現と糖鎖改変GAIの機能解析を目的とする。本年度は、GAIの糖鎖機能を明らかにするため、(1)Ser/Thr残基に最初のマンノースを付加するprotein mannosyltransferaseをコードする黒麹菌のpmt遺伝子クローニングと(2)Gp-I領域変異の黒麹菌GAIの分泌への影響について検討を行った。(I)昨年度の研究成果としてクローン化したA.nidulansのpmtA遺伝子をDNAプローブとして黒麹菌A.aw am ori var.kaw achiのゲノムライブラリーからpmtA遺伝子をクローニングした。cDNAはRT-PCR法により増幅し、取得した。黒麹菌pmtA遺伝子は4つのイントロンを含む2.5kbからなり、741アミノ酸をコードしていた。また、A.nidulansと最も高い相同性(80.4%)を示したが、酵母や動物細胞由来のPMTとの相同性は19.3〜48.5%であった。疎水性プロット解析によりPmtAは膜貫通タンパク質であることが示唆された。本成果によりpmt遺伝子破壊株構築によるGAI糖鎖の改変が期待できる。(II)O-型糖鎖結合Gp-I領域を完全に内部欠失した変異型GAI(GAΔGpI)を黒麹菌に導入し、野生型GAI遺伝子と部位特異的に組換えた形質転換体MG301を取得した。野生型及び変異型GAを発現させ、Gp-Iの役割について検討した。マルトースでGAの誘導後、親株ではGAIが多量に分泌したが、MG301ではGAΔGpIは分泌されなかった。また細胞内では、GAは親株では誘導後、1-5時間で認められたが、MG301株においては検出されなかった。また親株に比べMG301株において小胞体シャペロンであるbipA遺伝子の転写量とBipAタンパク質量が増加したことから、GAΔGpIが小胞体において正確に折り畳まれておらず、分解されたものと推察した。以上の結果から、Gp-Iドメインは末端ドメインの正確な折り畳みへと導くことでGAIの分泌に関与することを明らかにした。

Aspergillus aw am ori var.kaw achi secretes a Gp-I domain that binds to residues 1 - 3 of the O-type carbohydrate chain, enzyme activity and enzyme stabilization. The aim of this study was to investigate the expression and function of O-type glycan in Aspergillus spp. This year, we discussed the effects of GAI secretion on (1)Ser/Thr residues on initial protein mannosyltransferase expression in Aspergillus niger and (2)Gp-I domain variant Aspergillus niger. (I)A.nidulans pmtA gene DNA translation is the result of research conducted in the past year. cDNA amplification by RT-PCR The pmtA gene of Aspergillus niger contains 2.5kb DNA and 741 DNA. A.nidulans showed the highest identity (80.4%), while yeast and PMT from animal cells showed the highest identity (19.3 ~ 48.5%). The water quality analysis of PmtA film penetration The results of this study are expected to be improved by the construction of GAI sugar locks. (II) O-type glycan binding Gp-I domain is completely internal to the absence of heterotypic GAI(GAΔGpI), which is introduced into black Aspergillus, wild-type GAI gene, and site-specific structural transformation MG301 is obtained. Wild-type and heterotypic GA were discovered, and Gp-I was detected. After GA induction, the parent plant secretes more GAΔGpI than MG301. After induction, 1-5 days later, MG301 strain was identified. Compared with MG301 strain, GAΔGpI increased the content of bip A gene and the quality of bip A gene. The above results show that the GAI secretion is related to the GAI secretion.

项目成果

M.Goto: "Functional analysis of O-linked oligosaccharide in threonine/serine-rich region of Aspergillus glucoamylase by expression in yeast"European Jounal of Biochemistry. 260・3. 596-602 (1999)

M.Goto：“通过在酵母中表达对曲霉葡糖淀粉酶富含苏氨酸/丝氨酸区域的O-连接寡糖进行功能分析”欧洲生物化学杂志260・3（1999）。

後藤正利: "黒麹菌グルコアミラーゼの生澱粉吸着ドメイン及びO-型糖鎖結合ドメインの機能解析."生物機能の新展開-人類の生存をかけて. 2(印刷中). (2001)

Masatoshi Goto：“曲霉属葡糖淀粉酶的原始淀粉吸附结构域和 O-聚糖结合结构域的功能分析。”生物功能的新进展 - 危及人类生存 2（出版中）。

後藤正利: "黒麹菌グルコアミラーゼによる生澱粉の分解"バイオサイエンスとインダストリー. 59・3(印刷中). (2001)

Masatoshi Goto：“米曲霉葡糖淀粉酶对生淀粉的降解”，《生物科学与工业》59, 3（出版中）。

後藤正利: "黒麹菌グルコアミラーゼのO-型糖鎖結合ドメインの機能解析"RADIOISOTOPES. 48・12. 771-772 (1999)

后藤正敏：“米曲霉葡糖淀粉酶的 O-聚糖结合域的功能分析”RADIOISOTOPES 771-772 (1999)。