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老化色素リポフスチン中の蛍光物質に関する化学的研究

老化色素脂褐素中荧光物质的化学研究

基本信息

批准号：
11760090
负责人：
板倉厚一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Aichi University of Education
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11760090/
关键词：
リポフスチン蛍光過酸化脂質タンパク質

项目摘要

老化色素リポフスチン中に存在している蛍光物質の生成には、脂質過酸化産物の一つである4-hydroxy-2-nonenal(HNE)によるタンパク質のリジン残基修飾が関与しているといわれている。我々はすでに、HNEとリジンとのモデル反応から蛍光物質を単離し、その化学構造が2-hydroxy-3-imino-1,2-dihydropyrrole derivative(HIDP)であることを明らかにしている。平成11年度では、このHIDPをタンパク質レベルにおいて検出する目的で、HNE修飾タンパク質を酵素により加水分解し、それをHPLCで分析した。検出には、インテリジェントマルチチャンネル検出器と蛍光検出器を用いた。しかしながら、生成量が微量のため検出には至らなかった。そこで平成12年度では、HIDPを特異的に認識するモノクローナル抗体の作成を行い、それを用いたHIDPの免疫化学的検出方法の確立を検討した。まず初めにHNEとリジンとの反応から抗体作成に必要量のHIDPを調製し、これをキャリアタンパク質(keyhole limpet hemocyanin,KLH)に結合させ、これを抗原としてマウスに免疫した。KLHへのHIDPの結合にはカルボジイミド法とマレイミド法を検討したが、マレイミド法の方が結合効率が高かったので、こちらを採用した。免疫後、HNE修飾タンパク質に対する抗体価の上昇がみられたので、マウスの脾細胞とミエローマ細胞を細胞融合させ、HIDPを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを得た。そこでこの抗体を用いて、銅イオンで酸化させた低比重リポタンパク質に対してウェスタンブロッティングを行ったところ、陽性反応が認められた。さらに、ヒト動脈硬化病巣に対して組織染色を行ったところ、これについても陽性反応を示した。

There are some compounds in aging pigments, such as the formation of phosphor, the acidification of phosphine, the formation of 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), the modification of residues, and the formation of acid compounds. We need to know how to use 2-hydroxy-3-imino-1,2-dihydropyrrole derivative (HIDP) chemically and chemically. We need to know how to do this. Pingcheng 11, HIDP, HPLC, enzyme, enzyme and analysis. The light exporter uses the light exchanger. The amount generated is trace amount, and the output is from trace to low volume. In the 12th year of Pingcheng, the special knowledge of HIDP, the antibody was made into a line, and the immunochemical method of immune HIDP was used to make sure that it was confirmed. In the first place, the anti-HNE antibody was made into the necessary amount of HIDP antibody, keyhole limpet hemocyanin,KLH antibody, antigen antibody and immune antibody. The combination of KLH, HIDP and other methods can be used to determine the accuracy of the method. After immunization, HNE was immunized with monoclonal antibodies, spleen cells, spleen cells, fusion cells, HIDP specific antibodies, antibody, antibody, The antibody was acidified with low specific gravity, low specific gravity and low specific gravity. The tissue staining of animal sclerotic disease and animal sclerotic disease showed that there was no sexual reaction.