ヒトケラチノサイトの分化制御転写因子遺伝子のクローニングとその発現についての検討

人角质形成细胞分化控制转录因子基因的克隆及其表达研究

• 批准号: 11770444
• 负责人: 小林 孝志
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770444/
• 关键词: ケラチノサイト; 分化; matrix metalloproteinase 9; インボルクリン; 転写因子; ワンハイブリッド法; glucose-6-phosphatase; MMP-9

1.転写因子候補クローンについての検討平成11年度の検討よりの候補クローン遺伝子2種のリコンビナント蛋白質についてのゲルシフトアッセイの結果、両者ともmatrix metalloproteinase 9およびインボルクリンプロモーターの遺伝子配列、KRE-M9およびKRE-4と結合することを確認した。一方(候補1)は細胞内蛋白としてヒト第5染色体上に存在していると報告されているが、アミノ酸配列から核内にも存在する可能性が強く示唆された。もう一方(候補2)の遺伝子配列はpoly Aを含む約800bpsであったため5'-RACE法を用い約1、200bpsまで、ヒトゲノムdata baseを用いて約1、500bpsまで5′端に遡って配列を決定した。本遺伝子はヒト第17染色体上に存在、アミノ酸配列からglucose-6-phosphataseと相同性を有する蛋白質であることが判明した。2.転写因子の発現についての検討(1)発現を検討するための準備転写因子遺伝子をpBluescript、GFP-N1およびpGEX-4Tのvectorに組み込み、probeを調製した。大腸菌の大量培養を行い、培養液よりGST gene fusion systemを用いてリコンビナント蛋白を得た。また合成ペプチドに対する兎ポリクローナル抗体を作成した。(2)発現の検討正常ヒト皮膚を用い、インサイチュハイブリダイゼーション法により候補2遺伝子が表皮基底層および直上細胞に特異的に局在すること、また免疫組織化学的に候補1蛋白が基底層、有棘層細胞の一部の核内および有棘層細胞の一部細胞質に局在することを確認した。また、候補1蛋白発現vectorをtransfectされた培養ケラチノサイトではインボルクリンの発現が認められないことを蛍光抗体法により確認した。

1. The results of the 11-year review of the candidate factors for candidate selection, matrix metalloproteinase 9 and KRE-4 were confirmed. One candidate (candidate 1) has a strong indication of the presence of intracellular proteins on chromosome 5. The data base of the candidate 2 is about 800 bps and the 5 '-RACE method is about 1 bps and 200 bps. The data base is about 1 bps and 500 bps. This gene is found on chromosome 17, and the nucleotide sequence, glucose-6-phosphatase, and protein identity are identified. 2. The detection of the occurrence of the write factor (1) The detection of the occurrence of the write factor (1) The preparation of the vector of the write factor (pBluescript, GFP-N1, pGEX-4T). Mass culture of Escherichia coli, culture medium, GST gene fusion system, and protein production. To prepare the antibody for the first time (2)The results showed that there were two kinds of protein in the basal layer of epidermis and one kind of cytoplasmic protein in the upper layer of epidermis. Candidate 1 protein discovery vector is identified by the light antibody method.

项目成果

Kobayashi T. et al.: "Systematic separation and purification of elastase, gelatinase (matrix metalloproteinase 9) and collagenase (matrix metalloproteinase 8) from polymorphonuclear leukocytes in dialyzers previously used by patients with renal failure."P

Kobayashi T. 等人：“在肾衰竭患者之前使用的透析器中，从多形核白细胞中系统地分离和纯化弹性蛋白酶、明胶酶（基质金属蛋白酶 9）和胶原酶（基质金属蛋白酶 8）。”P

Kobayashi T. et al.: "Differential regulation of the secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 from human keratinocytes in culture "IUBMB Life. 50. 221-226 (2000)

Kobayashi T. 等人：“培养物中人角质形成细胞基质金属蛋白酶 9 和金属蛋白酶组织抑制剂 1 分泌的差异调节”IUBMB Life。