除去修復酵素の細胞内分布と紫外線損傷生成に伴う反応

太陽紫外線はヒト皮膚の細胞DNAに損傷を誘起し、皮膚がんを発生させる。紫外線(UVC)により生じる主要な2つのDNA損傷はシクロブタン型ダイマーおよび(6-4)型ダイマーである。これまでに、私達は、DNA損傷特異モノクローナル抗体を共焦点レーザー顕微鏡に応用し、正常および色素性乾皮症患者由来細胞の個々の細胞核における損傷修復動態を3次元的に可視化することに成功した。本年度はその結果をさらに発展させ、細胞核内に限局的な損傷部位を誘発・可視化した。紫外線照射によるヒト細胞核内におけるDNA損傷部位やその修復部位と各種修復蛋白の挙動を実際の反応の場である細胞核と関連付けるため、正常ヒト細胞および除去修復に欠陥を持つ遺伝病、色素性乾皮症A群患者由来細胞(XP-A)にポリカーボネート製フィルターマスク(孔径3μm)を通してC紫外線100J/m^2を照射し、細胞核あたり数個の小円状のDNA損傷部位を作成し検討した。CPDも6-4PPも共に、免疫染色によりマスクの穴の孔径や分布に一致する水玉様に検出された。正常細胞は核全体に照射された場合と同様に、水玉様に誘発されたCPDを24時間で半分程度修復除去し、6-4PPを3時間以内で完全に修復したが、XP-A細胞は、同時間内に両損傷をまったく修復できなかった。更に、細胞核内の限局した部分に紫外線を照射し、除去修復酵素であるPCNAが損傷部位に一致して集まるかを検討した。正常細胞において、PCNAは照射後30分以内に核内に水玉様に染色されたが9-24時間にかけて次第に染色が弱くなった。XP-A細胞では、逆に照射後3時間まで染色は認められなかったが、9および24時間において水玉様に染色された。すなわち、正常細胞において、PCNAは紫外線照射に伴いDNA損傷部位に結合し、XP-A細胞においても、照射後9時間以降に次第にDNA損傷部位に結合することが示唆された。

太陽紫外線はヒト皮膚の細胞DNAに損傷を誘起し、皮膚がんを発生させる。紫外線(UVC)により生じる主要な2つのDNA損傷はシクロブタン型ダイマーおよび(6-4)型ダイマーである。これまでに、私達は、DNA損傷特異モノクローナル抗体を共焦点レーザー顕微鏡に応用し、正常および色素性乾皮症患者由来細胞の個々の細胞核における損傷修復動態を3次元的に可視化することに成功した。本年度はその結果をさらに発展させ、細胞核内に限局的な損傷部位を誘発・可視化した。紫外線照射によるヒト細胞核内におけるDNA損傷部位やその修復部位と各種修復蛋白の挙動を実際の反応の場である細胞核と関連付けるため、正常ヒト細胞および除去修復に欠陥を持つ遺伝病、色素性乾皮症A群患者由来細胞(XP-A)にポリカーボネート製フィルターマスク(孔径3μm)を通してC紫外線100J/m^2を照射し、細胞核あたり数個の小円状のDNA損傷部位を作成し検討した。CPDも6-4PPも共に、免疫染色によりマスクの穴の孔径や分布に一致する水玉様に検出された。正常細胞は核全体に照射された場合と同様に、水玉様に誘発されたCPDを24時間で半分程度修復除去し、6-4PPを3時間以内で完全に修復したが、XP-A細胞は、同時間内に両損傷をまったく修復できなかった。更に、細胞核内の限局した部分に紫外線を照射し、除去修復酵素であるPCNAが損傷部位に一致して集まるかを検討した。正常細胞において、PCNAは照射後30分以内に核内に水玉様に染色されたが9-24時間にかけて次第に染色が弱くなった。XP-A細胞では、逆に照射後3時間まで染色は認められなかったが、9および24時間において水玉様に染色された。すなわち、正常細胞において、PCNAは紫外線照射に伴いDNA損傷部位に結合し、XP-A細胞においても、照射後9時間以降に次第にDNA損傷部位に結合することが示唆された。