競合的RT-PCR法によるヒト肺サーファクタント蛋白質mRNA定量法の開発

竞争性RT-PCR法开发人肺表面活性蛋白mRNA定量方法

• 批准号: 11770617
• 负责人: 小俣 真
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770617/
• 关键词: ヒト肺サーファクタント蛋白; 競合的RT-PCR; サーファクタント; mRNA; PCR

1.競合的RT-PCR法による肺サーファクタント蛋白質(SP-A、B、C、D)mRNAの定量法の確立(1)肺mRNAの抽出肺組織からのtotal RNAの精製は、TRIZOL^<【○!R】> reagent(GIBCO BRI/Life Technologies)を用いて行った。RT-PCRに用いるサンプル量は、β-actin mRNAの定量で補正した。(2)サーファクタント蛋白質(SP-A、B、C、D)DNA competitor、RNA competitorの作製SP-Bについて、TaKaRa competitive DNA construction kit(宝酒造)を用いて、SP6プロモーター領域を持つDNA competitorを作製した。次いでこのDNA competitorを鋳型にしてRNA competitorを作製した。現在SP-A、C、Dについてもcompetitorを作製中である。(3)肺サーファクタント蛋白質mRNAの定量肺RNAと#2で作成したSP-BのRNA competitor(9段階に希釈、10^5〜10^9 copies)とを競合させてRT-PCRを行い、SP-BのcDNAの特異的塩基対を増幅した。PCR終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、泳動パターンからSP-BのRNA量判定を行った。すなわちSP-BのPCR産物と分子量の異なるcompetitorのPCR産物の発現量が同一レベルとなったRNA competitor量をRNA量とした。2.臨床例での検討肺疾患症例の剖検肺組織よりRNAを抽出し、上記の方法で競合的RT-PCR法を行うことにより、SP-B mRNAの発現状況を検索した。3.従来のノーザンブロット法との比較従来のノーザンブロット法との比較を行って、本研究によって開発された測定系の信頼性と有用性を検証した。

1. Establishment of a quantitative method for lung protein (SP-A, B, C, D)mRNA by RT-PCR in conjunction with PCR (1) Purification of total RNA from lung mRNA extracted from lung tissue, TRIZOL^<[0! R> reagent(GIBCO BRI/Life Technologies) RT-PCR was used to correct the quantitative analysis of β-actin mRNA. (2)Protein (SP-A, B, C, D)DNA competitor, RNA competitor production SP-B, TaKaRa competitive DNA construction kit(Bao Jiu Zao) for use, SP6 for production of DNA competitor. The DNA compettor is the most important factor in the production of DNA. Now SP-A, C, D are in the middle of the system. (3)Quantitative RNA analysis of SP-B mRNA was performed by RT-PCR and SP-B cDNA specific gene pairs were amplified. After PCR termination, the detection of SP-B RNA was performed. The molecular weight of the PCR product of SP-B is different from that of the competitor and the amount of the PCR product is the same as that of the RNA competitor. 2. To detect the expression of SP-B mRNA in lung tissue by RT-PCR, the method described above was used to detect the expression of SP-B mRNA in lung tissue. 3. The reliability and usefulness of the assay system were verified by comparing the two methods.

项目成果

小俣真,清水浩,小川雄之亮: "競合RT-PCRによるSP-B mRNA定量系の確立"日本小児科学会誌. 103. 125 (1999)

Makoto Omata、Hiroshi Shimizu、Yunosuke Okawa：“通过竞争性 RT-PCR 建立 SP-B mRNA 定量系统” 日本儿科学会杂志 103. 125 (1999)。

清水浩,荒川浩,小俣真,佐野仁美,小川雄之亮: "肺胞蛋白症"日本胸部臨床. 59・11. S256-S262 (2000)

Hiroshi Shimizu、Hiroshi Arakawa、Makoto Omata、Hitomi Sano、Yunosuke Okawa：“肺泡蛋白沉积症”日本胸科诊所。

小俣真: "競合RT-PCRによるSP-B mRNA定量系の確立"日本小児科学会雑誌. 103.2. 125 (1999)

Makoto Omata：“通过竞争性 RT-PCR 建立 SP-B mRNA 定量系统”，日本儿科学会杂志 103.2（1999）。