粘菌レクチンをモデルタンパクとした機能性タンパクの分泌とその制御機構の解析

以粘菌凝集素为模型蛋白分析功能蛋白分泌及其调控机制

• 批准号: 11771430
• 负责人: 守田 雅志
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771430/
• 关键词: 真正粘菌; 分泌; レクチン; ポリクローナル抗体; ABCトランスポーター; Walker Aモチーフ; RT-PCR; 過剰発現細胞

粘菌レクチンをモデルタンパク質として用い、小胞体を介さないタンパク質の分泌の制御機構について調べる目的で、本年度はレクチンの動物細胞での発現と分泌、及び粘菌からの新規ABCトランスポーターの遺伝子クローニングを行った。その結果、新たな知見が得られたので報告する。1、粘菌レクチンの動物細胞での発現:粘菌レクチン遺伝子を動物発現用ベクターpCDNA3.1+に組み込み、CHO細胞にトランスフェクトした。イムノブロッティング法により目的のタンパクを発現している細胞を調べた。抗体は昨年度大腸菌で発現した組み換えレクチンをウサギに免疫して得られた血清を使用した。その結果いずれの細胞にも発現は認められず、レクチン自体が動物細胞に毒性を示した可能性が考えられた。今後はレクチン活性のない変異レクチンを発現して分泌を調べる必要があると考えられた。2、タンパク質の膜透過に関与する新規のトランスポーターの存在とその制御機構:真正粘菌Physarum polycephalumの変形体よりmRNAを調製し、ABCトランスポーターファミリーに共通なモチーフ配列を元にプライマーを作製し、RT-PCR法により遺伝子をクローニングした。その結果2種類の遺伝子をクローニングすることができた。推定されるアミノ酸配列には、ATPaseに特徴的なWalker AモチーフとWalker Bモチーフ配列、及びABCトランスポーターに特徴的なLinker peptide配列がよく保存されていた。しかし、膜貫通ドメインは認められず、ヌクレオチド結合ドメインのみからなることが推定された。得られた2種類の遺伝子のアミノ酸配列について系統樹を作製したところこの遺伝子産物は大腸菌のマルトーストランスポートシステムの様なimport systemではなく、P糖タンパク質やCFTRの様なexport systemであることが推察された。

Slime mold レ ク チ ン を モ デ ル タ ン パ ク qualitative と し て in い, small cell body を interface さ な い タ ン パ ク qualitative の の secretion system royal institution に つ い て adjustable べ で る purpose, this year's は レ ク チ ン の animal cell で の 発 と secretion, and び slime mold か ら の new rules on ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の heritage 伝 son ク ロ ー ニ ン グ を line っ た. Youdaoplaceholder0 そ results, new たな insights が られた で で report する. 1, the slime mold レ ク チ ン の animal cell で の 発 now: slime mold レ ク チ ン heritage 伝 son を animal 発 current ベ ク タ ー pCDNA3.1 + に group み 込 み, CHO cells に ト ラ ン ス フ ェ ク ト し た. イ ム ノ ブ ロ ッ テ ィ ン グ method に よ り purpose の タ ン パ ク を 発 now し て い る cells を adjustable べ た. Antibody は yesterday annual coliform で 発 now し み た group in え レ ク チ ン を ウ サ ギ に immune し て have ら れ た serum を use し た. そ の results い ず れ の cells に も 発 は now recognize め ら れ ず, レ ク チ ン autologous が animal cell toxicity of に を shown し た possibility が exam え ら れ た. Future は レ ク チ ン active の な い - different レ ク チ ン を 発 now し て secretion を adjustable べ る necessary が あ る と exam え ら れ た. 2, タ ン パ ク qualitative の membrane through に masato and す る new rules の ト ラ ン ス ポ ー タ ー の is と そ の imperial institutions: real slime mold Physarum Polycephalum の - form よ り mRNA を modulation し, ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー フ ァ ミ リ ー に common な モ チ ー フ match column を yuan に プ ラ イ マ ー を し, rt-pcr method for system に よ り heritage 伝 son を ク ロ ー ニ ン グ し た. Youdaoplaceholder0 た result 2 types of cultural heritage 伝 sub-を ロ ロ ニ ニ グする グする とがで た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た. Presumption さ れ る ア ミ ノ acid with column に は, ATPase に of 徴 な Walker, A モ チ ー フ と Walker B モ チ ー フ columns, and び ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー に of 徴 な would peptide with column が よ く save さ れ て い た. し か し, transmembrane ド メ イ ン は recognize め ら れ ず, ヌ ク レ オ チ ド combining ド メ イ ン の み か ら な る こ と が presumption さ れ た. Son must ら れ た 2 kinds の heritage 伝 の ア ミ ノ acid with column に つ い て を cropping system tree し た と こ ろ こ の heritage 伝 zi chan content は coliform の マ ル ト ー ス ト ラ ン ス ポ ー ト シ ス テ ム の others な import system で は な く, P sugar タ ン パ ク qualitative や CFTR の others な export systemである された とが inference された.

项目成果

Morita M et al.: "Insulin-degrading enzyme exists inside of rat liver peroxisomes and degrades oxidized proteins."Cell Structure and Function. 25. 299-305 (2000)

Morita M 等人：“胰岛素降解酶存在于大鼠肝脏过氧化物酶体内部，可降解氧化蛋白质。”细胞结构和功能。

Okamura, S. et al.: "Isotype-specific changes in the amount of β-tubulin RNA in synchronized tabacco BY2 cells."Cell Structure and Function. 24. 117-122 (1999)

Okamura, S. 等人：“同步烟草 BY2 细胞中 β-微管蛋白 RNA 量的同种型特异性变化。”细胞结构和功能。24. 117-122 (1999)

Nakagawa, T. et al.: "Peroxisomal membrane protein pmp47 is essential in the metabolism of middle-chain fatty acid in yeast peroxisomes and is associated with peroxisome proliferation"Journal of Biological Chemistry. 275. 3455-3461 (2000)

Nakakawa, T. 等人：“过氧化物酶体膜蛋白 pmp47 对于酵母过氧化物酶体中链脂肪酸的代谢至关重要，并且与过氧化物酶体增殖相关”《生物化学杂志》。