自己増殖能を有する多様性分子集団の構築とその機能探索

具有自我复制能力的多样化分子群的构建及其功能探索

• 批准号: 11780418
• 负责人: 江原 靖人
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780418/
• 关键词: DNA; ポリメラーゼ; 非天然; ライブラリー; コンビナトリアルケミストリー; 進化分子工学; 超分子

本研究の目的は有機化学と遺伝子工学を巧みに組み合わせることにより、分子の多様性と自己増殖能の両者を兼ね備えた、今までにはない新しい分子集団を構築し、その機能性を探索することである。平成11年度はDNAポリメラーゼの本来基質であるdCTP(デオキシシチジン3リン酸),dTTP(デオキシチミン3リン酸)の塩基部分に種々の糖鎖、アミノ酸を化学的に修飾した化合物を合成した。Heck反応を用いて、dCTP,dTTPの5'位に置換基を導入した。これらの合成した新しい基質が、Klenow FragmentによってDNA鎖内に取り込まれることをアクリルアミド電気泳動法により確認した。両端にPCR増幅(耐熱性のDNAポリメラーゼ、dATP,dCTP,dGTP,dTTP,プライマーというものを加えて反応することにより、1分子のDNAを何百万倍にも増幅させる事ができる)のための20mer程度のプライマーを有する全長90mer程度の化学合成DNAを用意した。この化学合成DNAを鋳型とし、プライマー、化学合成した新しい基質、DNAポリメラーゼを加えて、DNAの伸長反応を行なった結果、目的通り、合成した新しい基質がDNA内に取り込まれていることをゲル電気泳動解析より、確認した。これらの非天然ヌクレオチドのKlenow Fragmentによる導入効率は天然のものとくらべて30-50%を維持していた。この手法の特徴は、テンプレートを設計することにより、任意の官能基がオングストロームオーダーで並んだ超分子化合物を簡便に合成できることである。例えばグルコース修飾dUTPを用い、Aが5個連続したテンプレートとを用いて、グルコース残基がらせん構造に沿った構造のDNAが、またAが5個おきに並んだテンプレートを用いると、グルコース残基が左右交互に並んだDNAを合成できた。このように糖鎖がクラスター化した分子は、細胞表面の糖鎖のレセプターと高い親和性を有すると考えられる。

は の purpose this study traces of organic chemistry と 伝 engineering を qiao son み に group み close わ せ る こ と に よ り, molecular の others more sexual と his rights can yield の struck the を and ね prepared え た, today ま で に は な new し い い molecular set 団 を constructing し, そ の functional を explore す る こ と で あ る. Pp.47-53 11 は DNA ポ リ メ ラ ー ゼ の original matrix で あ る dCTP (デ オ キ シ シ チ ジ ン 3 リ ン acid), dTTP (デ オ キ シ チ ミ ン 3 リ ン acid) の salt base part に kind 々 の sugar lock, ア ミ を ノ acid chemical modification of に し を た compounds synthesized し た. Check the inverse 応を and import the に permutation base を at the <s:1> 5' position of dCTP and dTTP into た. New し こ れ ら の synthetic し た が い matrix and Klenow Fragment に よ っ て in DNA lock に take り 込 ま れ る こ と を ア ク リ ル ア ミ ド 気 swimming method に よ り confirm し た. That struck the に PCR rights (heat-resistant の DNA ポ リ メ ラ ー ゼ, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, プ ラ イ マ ー と い う も の を plus え て anti 応 す る こ と に よ り one million times, 1 molecular の DNA を に も rights of さ せ る matter が で き る) の た め の killing 20 degree の プ ラ イ マ ー を have す る 90 killing Degree of chemical synthesis of DNAを intention of た. Type こ の chemical synthetic DNA を where と し, プ ラ イ マ ー, chemical synthesis し た new し い matrix, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ を plus え て, DNA の elongation 応 を line な っ た results, purpose り and synthetic し た new し い matrix が DNA に take り 込 ま れ て い る こ と を ゲ ル electric 気 swimming parsing よ り, confirm し た. こ れ ら の unnatural ヌ ク レ オ チ ド の Klenow Fragment に よ る import working rate は natural の も の と く ら べ て 30-50% を maintain し て い た. こ の gimmick の, 徴 は, テ ン プ レ ー ト を design す る こ と に よ り, arbitrary の functionality が オ ン グ ス ト ロ ー ム オ ー ダ ー で and ん だ を simple に supramolecular compounds synthesis で き る こ と で あ る. Example え ば グ ル コ ー ス modified dUTP を い, A 5 even 続 が し た テ ン プ レ ー ト と を with い て, グ ル コ ー ス residues が ら せ に ん structure along the っ た tectonic の が DNA, ま た A が five お き に and ん だ テ ン プ レ ー ト を with い る と, グ ル コ ー ス residues が に about interaction and ん だ を DNA synthesis で き た. こ の よ う に sugar lock が ク ラ ス タ ー change し た molecular は, cell surface の sugar lock の レ セ プ タ ー と い high affinity を have す る と exam え ら れ る.

项目成果

Y.Ebara: "Synthesis of non-natural DNA using DNA polymerase"Nucleic Acids Symposium Series. 44. 143-144 (2000)

Y.Ebara：“使用 DNA 聚合酶合成非天然 DNA”核酸研讨会系列。

Y.Ebara: "Construction of non natural DNA Library"Nucleic Acids Symposium Series. 42. 175-176 (1999)

Y.Ebara：“非天然DNA文库的构建”核酸研讨会系列。