哺乳類でのエンドサイトーシス経路とその調節の分子機構の細胞工学的手法による解明

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哺乳類のエンドサイトーシス後期過程の膜動態とそれを駆動する分子機構には不明な点が多い。これらを解明するために体細胞遺伝学的なアプローチは有力でありうるが、おもに変異株やその復帰変異体を分離分析するための有効な方法の欠如のためこれまで系統的に行われてこなかった。我々は、エンドサイトーシス経路の分子メカニズムを解明するために、セルソーターを用いた独自の工夫により、低密度リポタンパク質のリソゾームでの分解が遅いCHO変異株群を得、それらの解析を行ってきた。これまでに、これらの変異株が、エンドサイトーシス前期過程は正常であるが、後期過程になんらかの異常を持っていること、また、すべてが劣性の変異を持ち、相補性試験の結果、3つの異なる相補群に分類されることを明らかにしてきた。本年度は(1)蛍光観察により輸送系を定量的に解析する方法、および(2)CHO細胞におけるレトロウイルスベクターを介した発現クローニング法を確立した。これらの方法を利用して、変異株の解析を進めることにより、以下の点を明らかにした。第一に、エンドソーム後期過程は遺伝子の変異によって規定される複数の独立膜動過程に分けられ、分子選別過程またはその前過程に関わる一時的なコンパートメントの段階と、分子選別の完了したさらに後期のエンドソームの段階、そしてさらに進んだごく後期のエンドソームとリソゾームの直接相互作用段階が存在することを明らかにした。第二に、これらの後期エンドソーム膜動輸送の特定の進行過程にコレステロールが要求される事を明らかにした。