カエル骨格筋の興奮・収縮連関における2種類のリアノジン受容体の生理的機能の検討

两类兰尼碱受体在青蛙骨骼肌兴奋-收缩关系中的生理功能研究

• 批准号: 12770044
• 负责人: 鈴木 恵理香
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research (2001)Juntendo University (2000)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770044/
• 关键词: カエル骨格筋; ジヒドロピリジン受容体; リアノジン受容体; GLT細胞株

哺乳類の骨格筋にはジヒドロピリジン受容体(DHPR)が1種類とリアノジン受容体(RyR)が主に1種類存在している。カエル骨格筋のDHPRの各サブユニットやRyRのcDNAのクローニングよりDHPRが1種類、RyRが2種類存在することが明らかとなった。そこでこの2種類のRyRの生理機能の違いを解明するため本研究を行った。DHPRα1s欠損GLT細胞株(dysgenic mouse骨格筋由来細胞株)において、相同組換えとリガンド依存性Creリコンビナーゼによる部位特異的遺伝子組換えを併用した遺伝子ノックアウト法を用い、内在性マウスRyR遺伝子をノックアウトしてカエルのDHPRα1sとα-RyRまたはβ-RyRを発現できる培養細胞系の作製を計画した。発現ベクターの作製…断片化されたままのDHPRα1sサブユニット約7kbを発現ベクターのpCI neoに構築した。αとβの2種類のRyR、それぞれ全長約15kbをpcDNA3.1/Hygに構築した。各クローンの5末端は開始メチオニンの上流にコザック配列を組み込み、その上流に発現ベクターに挿入できるサイトを作製した。ライブラリースクリーニングから得られた断片クローンにはオーバーラップの領域が短く、直接は結合が不可能な箇所がいくつかあった。その点に関してはオーバーラップ領域をPCRで再クローニングし、シークエンスをして配列を確認して構築に用いた。構築する際に不都合になる内在性制限酵素サイトはあらかじめアミノ酸配列に変化を起こさないよう塩基配列に変異を入れて用いた。また、DHPRα1sサブユニットとRyRに対する抗体を作製し、それぞれのタンパク質が培養細胞で発現することを確認した。培養細胞の準備…GLT細胞株の入手が困難になったため、新たなdysgenic mouse骨格筋由来細胞株の樹立を行うか、または骨格筋由来の培養細胞のDHPRα1sサブユニットとRyRのダブルノックアウトを行ってGLT細胞株にかわる培養細胞を確立することを考えた。現時点では新たなdysgenic mouse骨格筋由来細胞株の樹立を行おうとしている。

Mammalian skeletal muscle is divided into two types: DHPR and RyR. DHPR and RyR cDNA have 1 species and 2 species respectively. The physiological function of two kinds of RyR was studied in this paper. DHPR α 1s deficient GLT cell line (dysgenic mouse bone tendon derived cell line) is a cell line for culture of DHPRα 1s and α-RyR. DHPRα1s fragment is about 7kb long and pCI neo is constructed. The total length of the two kinds of RyR, α and β is about 15kb. pcDNA3.1/Hyg is constructed. Each of the 5 ends of the channel starts to change. The upstream channel is arranged in a group. The upstream channel is arranged in a group. The upstream channel is arranged in a group. The domain of the game is short, and the direct combination is impossible. For example, if you are interested in a project, you may want to re-establish the project. When constructing, the intrinsic restriction enzyme starts to change. DHPRα1 is a protein that can be detected in cultured cells. The preparation of cultured cells is difficult for GLT cell lines to start, and the establishment of new dysgenic mouse derived cell lines is difficult for DHPRα1s to start. A new dysgenic mouse is established.