3次元細胞培養を用いた新しい真珠腫性中耳炎モデルの作製

研究成果1.慢性中耳炎5例に対し、手術時に除去された中耳腔内の肉芽を採取、ミンチし培養液(Dulbeco's modification of Eagle's medium)にて洗浄した。その後30mg/mlの割合で新しい培養液を加え、37℃、95%air/5%C02環境下で7日間培養した。培養液は毎日交換し、古い培養液(GTCM ; granulation tissue conditioned medium)を-20℃にて保存した。5例中、1例は3日目にcontaminationを起こし、4例は7日間培養することが可能であった。2.正常ヒト表皮角化細胞(EPI-100,KURABO)を37℃、95%air/5%C02環境下で3次元培養し、GTCM 100μl添加した。同時にEGFを1ng/ml、5ng/ml、10ng/mlと各モデルで濃度を変え添加した。GTCM/EGF添加24時間後に10%ホルマリンを用い、室温で一晩固定後、パラフィン包埋し、6μmの厚さで切片を作製した。3.免疫組織化学的手法を用い、真珠腫性中耳炎に特徴的なサイトケラチン(サイトケラチン13および16)の発現を調べた結果、サイトケラチン13は基底層に、サイトケラチン16は有棘層、顆粒層に部分的にみられた。EGFの濃度差による違いは明らかではなかった。今後の研究の展開現在まで行った細胞培養ではサイトケラチンパターンが真珠腫性中耳炎に特異的なものではなかった。今後はEGF以外の各種成長因子(IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β)を種々の濃度で、単独あるいは複数添加し、重層構造を持つ新しい真珠腫性中耳炎モデルを作製する。

研究成果1.慢性中耳炎5例に対し、手術時に除去された中耳腔内の肉芽を採取、ミンチし培養液(Dulbeco's modification of Eagle's medium)にて洗浄した。その後30mg/mlの割合で新しい培養液を加え、37℃、95%air/5%C02環境下で7日間培養した。培養液は毎日交換し、古い培養液(GTCM ; granulation tissue conditioned medium)を-20℃にて保存した。5例中、1例は3日目にcontaminationを起こし、4例は7日間培養することが可能であった。2.正常ヒト表皮角化細胞(EPI-100,KURABO)を37℃、95%air/5%C02環境下で3次元培養し、GTCM 100μl添加した。同時にEGFを1ng/ml、5ng/ml、10ng/mlと各モデルで濃度を変え添加した。GTCM/EGF添加24時間後に10%ホルマリンを用い、室温で一晩固定後、パラフィン包埋し、6μmの厚さで切片を作製した。3.免疫組織化学的手法を用い、真珠腫性中耳炎に特徴的なサイトケラチン(サイトケラチン13および16)の発現を調べた結果、サイトケラチン13は基底層に、サイトケラチン16は有棘層、顆粒層に部分的にみられた。EGFの濃度差による違いは明らかではなかった。今後の研究の展開現在まで行った細胞培養ではサイトケラチンパターンが真珠腫性中耳炎に特異的なものではなかった。今後はEGF以外の各種成長因子(IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β)を種々の濃度で、単独あるいは複数添加し、重層構造を持つ新しい真珠腫性中耳炎モデルを作製する。