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放線菌によるリグニン関連芳香族化合物の代謝及び微生物変換に関する基礎研究

放线菌代谢及微生物转化木质素相关芳香族化合物的基础研究

基本信息

批准号：
12875159
负责人：
西村基弘
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Ube National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、低分子リグニン資化性放線菌NL15-2K株の染色体DNAより得たバニリン酸脱メチル化酵素(VDM)遺伝子について、以下の項目を実施した。1.放線菌宿主Streptmyces lividans 1326における当該遺伝子の発現とノーザン解析2.当該遺伝子産物の基質特異性について1については、始めにVDM遺伝子を含む4.3kb断片を、あらかじめmelプロモーターを除去したプリスミドベクターplJ702にサブクローニングし形質転換体VDM01を得た。ついで、このクローンを、バニリン酸を唯一の炭素源とする培地にて培養後、酵素活性の検出と並行してtotal RNAを調製し、ノーザン解析を行った。VDM-mRNAを検出するためのプローブは、VDMに共通する鉄-硫黄結合ドメインに対するオリゴヌクレオチドを使用した。その結果、本クローンよりVDM活性の発現を確認するとともに、約3.7kbの位置にプローブとハイブリダイズするRNAを検出した。このことから、VDM01における本遺伝子の発現には同断片に含まれる独自のプロモータが利用されることが確認された。また、放線菌由来のVDMも他のVDMと同様に二つの遺伝子産物VanA及びVanBによって構成される可能性が示唆された。2については、当初VDM01の無細胞抽出液を用いて調べることを試みたが、in vitroの条件下ではVDM活性が得られなかったため、hole cellsを用いて基質特異性を調べた。その結果、ベラトルム酸、バニリン酸及びイソバニリン酸に対しては脱メチル化活性が認められたが、グアヤコールについては基質として認識しないことが判明した。今後は、引き続きVDM01のcell free系での活性検出を可能にするための検討を行うとともに、その抽出液からのVDM酵素の単離を試みる。

This year, the chromosome DNA of the low molecular weight mutant strain NL15-2K was detected and the following items were implemented. 1. 2. When the gene product is substrate-specific, the VDM gene contains a 4.3kb fragment, and the VDM gene is initially detected. After incubation, enzyme activity and total RNA modulation and analysis were performed. VDM-mRNA expression in the expression of iron and sulfur in the expression of VDM The results showed that the expression of VDM activity was detected at a position of about 3.7 kb. This is the first time that the VDM has been identified. The possibility of the formation of VDM and other VDM from the origin of VDM, VDM and VDM from the two genetic products VanA and VanB is shown. 2. VDM01 cell-free extract was used to modulate VDM activity in vitro. The results showed that the catalytic activity of various acids, such as hydrochloric acid, hydrochloric acid and hydrochloric acid, was significantly higher than that of other acids. In the future, the activity of VDM01 cell free system may be detected by the enzyme isolation test.