植物病原系状菌の逆転写酵素の大量生産と其の利用

植物病原真菌逆转录酶的规模化生产及利用

• 批准号: 13876008
• 负责人: 羽柴 輝良
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13876008/
• 关键词: RS224-1 ORF; RS224-1 発現ベクター; 逆転写酵素; 92kDaタンパク質; RS224の大腸菌内発現; ミトコンドリア内在性プラスミド; pRS224; RS224; 転写産物

大腸菌によるRS224-1タンパク質(逆転写酵素)の大量発現系の確立を行った。鋳型となるRS224-1 ORFはnested PCRにより両末端にBamH1リンカーを付加して増幅した。得られた約2.7kbpの増幅産物をクローニングし、シークエンスを行い、得られた増幅断片がRS224-1 ORFであることを確認した。得られたRS224-1 ORFを大腸菌用のタンパク質発現ベクター、pET11a-RS224-1 ORFを作成した。作成したpET11a-RS224-1 ORFを大腸菌BL21(DE3)-CodonPlusRILに導入し、37℃で培養後IPTGによって誘導をかけ、T7・Tag-RS224-1融合タンパク質の発現を試みた。不溶性画分、可溶性画分の両方に分子量約92kDaのタンパク質(逆転写酵素)が発現していることを確認した。抗T7・Tag抗体結合アガロースビーズ充填カラムを用い、T7・Tag-RS224-1融合タンパク質の精製を試みた。T7・Tag-RS224-1融合タンパク質を発現させた大腸菌BL21(DE3)-CodonPlusRILの不溶性画分はSDS-PAGEで展開し、目的タンパク質を含むゲルを切り出し、SDSを含むTrisバッファーで溶出させた。溶出液はSDSを含まないPBSバッファーで透析した後、抗T7・Tag抗体結合アガロースビーズを充填したカラムに通過させた。低pHの溶出バッファー中には分子量92kDaのタンパク質が含まれ、本タンパク質は目的のT7・Tag-RS224-1融合タンパク質(逆転写酵素)であることをアミノ酸配列より確認した。大腸菌BL21(DE3)-CodonPlusRILの可溶性画分に発現しているT7・Tag-RS224-1融合タンパク質について、逆転写酵素の活性を測定した。本タンパク質は逆転写酵素活性を示したことから、本方法によって逆転写酵素を大量に発現させる可能性が示唆された。

大肠杆菌建立了RS224-1蛋白（逆转录酶）的大规模表达系统。模板RS224-1 ORF通过在两端添加BAMH1链接器通过嵌套PCR扩增。克隆大约2.7 kbp的结果放大产物，并测序以确认所得的放大片段为RS224-1 ORF。所得RS224-1 ORF作为大肠杆菌，PET11A-RS224-1 ORF的蛋白表达载体制备。将制备的PET11A-RS224-1 ORF引入了大肠杆菌BL21（DE3）-codonplusril，在37°C下培养，并由IPTG诱导，并试图表达T7-TAG-RS224-1融合蛋白。已经证实，在不溶性和可溶性馏分中表达了大约92 kDa的分子量的蛋白质（逆转录酶）。使用装有抗-T2抗体偶联琼脂糖珠的柱纯化T7 TAG-RS224-1融合蛋白的纯化。使用SDS-PAGE开发了表达T7-TAG-RS224-1融合蛋白的大肠杆菌BL21（DE3）-codonplusril的不溶性部分，并使用含有TRI的SDS含有SDS-PAGE进行了SDS-PAGE，并用含有SDS的Tris缓冲液洗脱了含有靶蛋白的凝胶。用无SDS的PBS缓冲液透析洗脱体，然后通过装有抗T7-TAG抗体偶联的琼脂糖珠的柱。低pH洗脱缓冲液含有分子量为92 kDa的蛋白质，并且从氨基酸序列中证实，该蛋白是靶标T7-TAG-RS224-1融合蛋白（逆转录酶）。测量了在大肠杆菌BL21（DE3）-codonplusril的可溶性分数中表达的T7-TAG-RS224-1融合蛋白的逆转录酶的活性。该蛋白质表现出逆转录酶的活性，表明该方法可能会导致大量逆转录酶表达。

项目成果

A.Nagasaka: "Expression and localization of the linear DNA Plasmid-encoded protein (RS224) in Rhizoctonia solani"J. General Plant Pathology. (in press). (2003)

A.Nagasaka：“线性 DNA 质粒编码蛋白 (RS224) 在立枯丝核菌中的表达和定位”J。

Katsura K., et al.: "Complete nucleotide sequence of the liner DNA plasmid pRS224 with hairpin loops fro Rizoctonia solani and its unique transcriptional form"Current Genetics. 40. 195-202 (2001)

Katsura K.等人：“来自立枯丝核菌的带有发夹环的线性DNA质粒pRS224的完整核苷酸序列及其独特的转录形式”Current Genetics。