血管新生抑制因子としてのコンドロモジュリン-Iによる眼球組織内血管新生の制御

软骨调节蛋白-I 作为血管生成抑制剂控制眼组织中的血管生成

• 批准号: 13877285
• 负责人: 吉澤 豊久
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877285/
• 关键词: 眼内血管新生抑制因子; 滲出型加齢黄斑変性病; 脈絡膜新生血管; ラット; 滲出型加齢黄斑変性症

実験方法1)片眼を1%トロピカミド点眼にて散瞳した.ブラウンノルウェーラット、メス、体重120-200gのラットにケタミン11mg/kg、キシラジン14mg/kgを腹腔内注射し、全身麻酔施行。2)全麻下で網膜光凝固、Krypton red laser(647nm)、100μm、0.1s、120mW、で後極部に10発施行し、脈絡膜新生血管を誘発し、脈絡膜新生血管モデルを作成。3)眼底写真、フルオレセイン蛍光眼底造影(FAG)は眼底カメラで1日、3日、1週、2週、1月、2月、3月、4月、5月、6月後に施行。4)組織学的検討は1週、2週、1月、3月、6月後に、ラットにペントバルビタールを大量投与後、眼球を摘出し、メチルカルノアにて固定。パラフィン包埋し、2μmの厚さの切片を作成。切片はヘマトキシリン染色と抗RECA-1(rat endothelial cell antigen)による免疫染色を行い、血管新生の経時的変化を観察。5)眼球摘出後網膜を分画し網膜のタンパクを抽出する。サンプルはコントロール、レーザー施行後3日、1週、2週、1月、3月、6月後の眼球から抽出。12.5%のアクリルアミドゲルを作成し、各10μgずつ電気泳動。ニトロセルロースメンブレンを使用しWestern blottingを施行。一次抗体にはanti-ChM-1 antibody(Haruko Funaki, IOVS 42:1193-1200,2001)を1:1000で使用し、二次抗体にはEnvison+Rabbit/HRP(DAKO)を1:1000で使用した。6)1)と同様の全麻下で、手術用顕微鏡下にて耳上側の結膜を切開し、強膜を露出。30G針で強膜を擦り脈絡膜をわずかに露出し、30G針を網膜下に挿入する。ハミルトンシリンジ、ハミルトンリピーティングディスペンサーを使用し、Green flourescein protein(GFP)発現ベクター(C-Terminal Fluorescnent Protein Vector pEGFP-C1,Clontech lab)を5μ1(20μg)を網膜下に注入。注入後3日、5日、1週後に、Scanning laser ophthalmoscope(SLO)にてGPF発現を観集。7)ChM-1のcDNAを導入したpCNX2高発現プラスミドベクターを精製し、10mM Tris-HCl(0.14M Nacl含)pH8.0、濃度3.73mg/mLに調整し、網膜下に注入し、レーザー光凝固で誘発された2週から1月後の脈絡膜新生血管に対する効果をコントロールと比較検討中。結果および考察1)RECA-Iを使用した免疫組織染色でも1週後よりレーザー光凝固部に抗体で染色される新生血管内皮細胞が確認された。しかし、レーザー部位により所見に差があり、新生血管の確認できない部位もあった。以後3月後まで新生血管の進展、成長が確認できた。2)コンドロモジュリン-Iはレーザー光凝固施行3日後より減少し、1月後までほぼ不変で、3月後から少しずつ増加した。このことは血管新生抑制因子であるコンドロモジュリン-Iが減少することにより新生血管が発生し、3月後くらいから抑制因子が回復・増加してきて、6月後くらいから新生血管が萎縮・消退するという関係が示唆される.3)GFP発現ベクターの注入によるGFP産生がSLOで蛍光発色として明確に認められなかった。うまくいかない原因として、GFPが産生されているものがかなり少ない。注入量が少ない。網膜下にただ注入しただけでは導入できない。などが考えられる。今後、電気泳動法の併用などを検討中。

実験 method 1) 1% トロピカミド eye-dropping にて pupil dilation した.ブラウンノルウェーラット, メス, weight 120- 200g of のラットにケタミン 11mg/kg, キシラジン 14mg/kg were administered by intraperitoneal injection and general anesthesia. 2) Under general anesthesia, omental photocoagulation, Krypton red laser (647nm), 100μm, 0.1s, 120mW, posterior pole 10 発 execution, choroidal neovascularization induction, and choroidal neovascularization モデルを were performed. 3) Fundus photography, fundus angiography (FAG) and fundus imaging are performed on the 1st, 3rd, 1 week, 2 weeks, January, February, March, April, May and June. 4) Histological examination: After 1 week, 2 weeks, 1 month, 3 months and 6 months, the eyeball should be removed and fixed after large amounts of injection of ラットにペントバルビタールを. It is made of パラフィン embedded and 2μm thick slices. The sections were stained with fluorochrome and anti-RECA-1 (rat endothelial cell antigen), immunostained, and observed changes in angiogenesis. 5) After the eyeball is removed, the omentum is divided and the omentum is extracted. The eyeballs can be extracted 3 days, 1 week, 2 weeks, 1 month, 3 months, and 6 months after the administration of サンプルはコントロール and レーザー. Made of 12.5% ​​のアクリルアミドゲルを, 10μg each of electrophoresis.ニトロセルロースメンブレンを was performed using Western blotting. The primary antibody, anti-ChM-1 antibody (Haruko Funaki, IOVS 42:1193-1200, 2001), was used at 1:1000, and the secondary antibody, Envison+Rabbit/HRP (DAKO), was used at 1:1000. 6)1) The conjunctiva on the upper side of the ear is incised and the strong membrane is exposed under surgical microscopic surgery under general anesthesia. The 30G needle can strengthen the membrane and rub the choroid and expose it, and the 30G needle can insert it under the omentum. Green flourescein Protein(GFP) was injected subretinally in 5 μl (20 μg) of C-Terminal Fluorescnent Protein Vector pEGFP-C1, Clontech lab. 3 days, 5 days, and 1 week after the injection, the Scanning laser ophthalmoscope (SLO) and the GPF are displayed. 7) ChM-1 cDNA introduced into pCNX2 Takahata presently purified, 10mM Tris-HCl (0.14M Nacl contains) pH 8.0, concentration 3.73 mg/mL, adjustment, subretinal injection, and photocoagulation The effect of solid-induced choroidal neovascularization after 2 weeks and 1 month is relatively satisfactory. Results: 1) RECA-I was used to confirm the immunohistochemical staining of new vascular endothelial cells after 1 week using the antibody staining of the photocoagulated part of the RECA-I.しかし, レーザー区 によりObservation of に difference があり, new blood vessel のconfirmation できない地 もあった. The progress and growth of new blood vessels will be confirmed after 3 months. 2) 3 days after the photocoagulation of the コンドロモジュリン-IはレーザーIt will decrease after 1 month, it will not change after 1 month, and it will increase after 3 months. Angiogenesis inhibitory factorりNew blood vessel development, 3 months later, くらいから inhibitory factor recovery and increase, 6 months laterらいからNew blood vessels がatrophy・reduction するというrelations がshows instigation される.3) GFP発appears ベクInjection of GFP into the SLO produces a clear and clear color.うまくいかないcause として, GFPがproduce されているものがかなり小ない. The amount of injection is small. Subretinal にただinjection しただけでは introduction できない.などが卡えられる. From now on, the electrophoresis method will be used in conjunction with Nakoto.