ギャップ結合による細胞増殖制御の新しい分子機構の解明

本年度は前年度と同様に、酵母のtwo-hybrid法を用いてコネキシン26結合タンパクの候補となるクローンを単離し同定を試みるとともに、前年度に単離したクローンの解析を行った。baitとしてヒトコネキシン26の細胞内ループドメインを使用し、cDNAライブラリーとしてコネキシン26を高発現し機能の場と考えられている肝由来のものを構築して、多数回にわたってスクリーニングを行った。単離された陽性クローンのうち偽陽性のものやライブラリー作成時のartifactと考えられるものを除外し、現在40以上の陽性クローンを得ている。遺伝子のデータバンクを用いて解析したところ、これらの陽性クローンのいくつかは、細胞膜に局在するタンパクと細胞骨格とを連結する機能を有するMAGUK protein familyに属するものであったり、肝の毒物代謝に重要な役割を担うCytochrome P450 protein familyに属するものであるなど、ギャップ結合に機能的相互作用をもつことが示唆されているタンパクであった。そこで、このようなタンパクをコネキシン26結合タンパクの第一候補とみなし、タグ(Cellulose Binding Domain)を融合させた候補タンパクを大腸菌で大量産生し、cellulose affinity法でコネキシン26との結合を生化学的方法で検定したが、現在まで明らかな陽性を呈するクローンを得ることができていない。現在、タンパク間相互作用を生化学的に検出するために、より良い方法を検討中である。また、各クローンをHeLa細胞に遺伝子導入し、これらのクローンとコネキシン26の細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡を用いながら解析を進めている。

本年度は前年度と同様に、酵母のtwo-hybrid法を用いてコネキシン26結合タンパクの候補となるクローンを単離し同定を試みるとともに、前年度に単離したクローンの解析を行った。baitとしてヒトコネキシン26の細胞内ループドメインを使用し、cDNAライブラリーとしてコネキシン26を高発現し機能の場と考えられている肝由来のものを構築して、多数回にわたってスクリーニングを行った。単離された陽性クローンのうち偽陽性のものやライブラリー作成時のartifactと考えられるものを除外し、現在40以上の陽性クローンを得ている。遺伝子のデータバンクを用いて解析したところ、これらの陽性クローンのいくつかは、細胞膜に局在するタンパクと細胞骨格とを連結する機能を有するMAGUK protein familyに属するものであったり、肝の毒物代謝に重要な役割を担うCytochrome P450 protein familyに属するものであるなど、ギャップ結合に機能的相互作用をもつことが示唆されているタンパクであった。そこで、このようなタンパクをコネキシン26結合タンパクの第一候補とみなし、タグ(Cellulose Binding Domain)を融合させた候補タンパクを大腸菌で大量産生し、cellulose affinity法でコネキシン26との結合を生化学的方法で検定したが、現在まで明らかな陽性を呈するクローンを得ることができていない。現在、タンパク間相互作用を生化学的に検出するために、より良い方法を検討中である。また、各クローンをHeLa細胞に遺伝子導入し、これらのクローンとコネキシン26の細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡を用いながら解析を進めている。