Optical dissection of glycine and D-serine signalling using newly-developed sensors

使用新开发的传感器对甘氨酸和 D-丝氨酸信号传导进行光学解析

基本信息

项目摘要

Persistent changes of the strength of excitatory synaptic connections are thought to underlie learning processes. The induction of these changes often relies on a subtype of glutamate receptor, the so-called N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR). Activation of NMDARs also requires the binding of an NMDAR co-agonist, either D-serine or glycine. Therefore, their availability controls to what degree synaptic plasticity can occur. There is, however, an ongoing intense debate about the spatial extracellular distribution of D-serine and glycine, the mechanisms that control their extracellular concentration and the differential roles of neurons and astroglia in their supply.To directly study NMDAR co-agonists signalling, we previously designed novel optical NMDAR co-agonist sensors. We have succeeded in generating an optical FRET-based glycine sensor (GlyFS) and a D-serine sensor prototype (DSerFS). Using GlyFS we could recently verify important predictions about the distribution and development of resting glycine concentrations in the hippocampus and discovered that plasticity-inducing activity governs the extracellular glycine concentration. The exact mechanisms and the cellular sources of glycine remained, however, unclear. In the current project, we will further develop and refine optical sensors for glycine (GlyFS) and D-serine (DSerFS) while at the same time dissecting the mechanisms that control NMDR co-agonist levels. For glycine imaging, we will refine the current generation of GlyFS by exchanging the FRET-pair (fluorescent proteins) and by optimization of FRET donor/acceptor orientation, distance and interaction. We will also modify the sensor so it can be targeted to the surface of specific cell types and subdomains. Using the original GlyFS and improved versions we will establish how the frequency and strength of network activity determines extracellular glycine levels, which mechanisms contribute and what the relative role of neurons and astroglial are (in acute hippocampal slices). By optical recording of synaptic and extrasynaptic glycine concentrations we will visualize how the glycine concentration at the corresponding NMDAR populations is changed by activity. In parallel, we will test the current D-serine sensor prototype DSerFS and obtain first experimental results regarding D-serine signalling. For instance, it will be tested if direct and isolated stimulation of neurons or astrocytes increases extracellular D-serine levels. At the same time, we will improve the optical properties of DSerFS and its versatility by using the same techniques as outlined for GlyFS.Our work will provide new and important insights into NMDR co-agonist signalling and thus into NMDAR-dependent synaptic plasticity in the hippocampus. We will further add two optical sensors to the neuroscientist’s toolbox that will be important for studying memory formation and other NMDAR-dependent processes in the brain.
兴奋性突触连接强度的持续变化被认为是学习过程的基础。这些变化的诱导通常依赖于谷氨酸受体的亚型,即所谓的 N-甲基-D-天冬氨酸受体 (NMDAR)。 NMDAR 的激活还需要结合 NMDAR 共激动剂,即 D-丝氨酸或甘氨酸。因此,它们的可用性控制着突触可塑性发生的程度。然而,关于 D-丝氨酸和甘氨酸的空间细胞外分布、控制其细胞外浓度的机制以及神经元和星形胶质细胞在其供应中的不同作用,一直存在激烈的争论。为了直接研究 NMDAR 共激动剂信号传导,我们之前设计了新型光学 NMDAR 共激动剂传感器。我们成功地生成了基于 FRET 的光学甘氨酸传感器 (GlyFS) 和 D-丝氨酸传感器原型 (DSerFS)。使用 GlyFS,我们最近可以验证有关海马静息甘氨酸浓度分布和发展的重要预测,并发现可塑性诱导活性控制细胞外甘氨酸浓度。然而,甘氨酸的确切机制和细胞来源仍不清楚。在当前的项目中,我们将进一步开发和完善甘氨酸(GlyFS)和D-丝氨酸(DSerFS)的光学传感器,同时剖析控制 NMDR 共激动剂水平的机制。对于甘氨酸成像,我们将通过交换 FRET 对(荧光蛋白)以及优化 FRET 供体/受体方向、距离和相互作用来改进当前一代的 GlyFS。我们还将修改传感器,使其能够针对特定细胞类型和子域的表面。使用原始 GlyFS 和改进版本,我们将确定网络活动的频率和强度如何决定细胞外甘氨酸水平、哪些机制起作用以及神经元和星形胶质细胞的相对作用是什么(在急性海马切片中)。通过光学记录突触和突触外甘氨酸浓度,我们将可视化相应 NMDAR 群体的甘氨酸浓度如何随活动而变化。与此同时,我们将测试当前的 D-丝氨酸传感器原型 DSerFS 并获得有关 D-丝氨酸信号传导的第一个实验结果。例如,将测试对神经元或星形胶质细胞的直接和单独刺激是否会增加细胞外 D-丝氨酸水平。与此同时,我们将通过使用与 GlyFS 概述相同的技术来改善 DSerFS 的光学特性及其多功能性。我们的工作将为 NMDR 共激动剂信号传导提供新的重要见解,从而为海马中 NMDAR 依赖性突触可塑性提供新的重要见解。我们将进一步在神经科学家的工具箱中添加两个光学传感器,这对于研究大脑中的记忆形成和其他依赖 NMDAR 的过程非常重要。

项目成果

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