摂氏100度での蛋白質X線結晶構造解析

100摄氏度下蛋白质X射线晶体结构分析

• 批准号: 15657023
• 负责人: 渡邉 信久
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15657023/
• 关键词: タンパク質結晶; 構造解析; 高度好熱菌; 温度因子; 放射光; 放射線損傷; ラジカルスカベンジャー; 示差熱測定

1.手法の確立を目的とし,非常に再現性良く入手可能な卵白リゾチーム結晶を用いて,室温と高温のX線回折強度データ収集を行った.卵白リゾチームは,微量示差熱測定によって結晶中でも70度付近で熱変成することを確認している.測定は,実験室のX線発生装置と放射光ビームラインを用いて実施したが,高温で結晶が崩壊する前にデータを収集するには放射光利用が必須であった.データ解析の結果,リゾチームの場合には分子全体に渡って温度因子が均等に上昇しており,熱変成が分子の得意的部位から進行することを示唆するような結果は得られなかった.2.本年度解析を予定した高度好熱菌Pyrococcus horikoshii由来のタンパク質PH0670,PH1593の2つのタンパク質は,十分な品質の単結晶が得られなかった.3.高度好熱菌Pyrococcus horikoshii由来のタンパク質PH0612(MinD)について高温データ収集を試みた.このタンパク質は室温から摂氏70度以上に渡って活性測定がなされており,高温側での高活性が確認されている.しかし,PH0612の結晶は,本研究課題で開発した結晶マウント法によると,高温で良好な回折強度データを収集することが出来なかった.本課題では高温で結晶を保持するためにタンパク質結晶周辺の溶媒を十分に取り去って後オイル封入しているが,PH0612の結晶はMPD(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)を主要結晶化剤として使用しており,それが原因と考え,別の結晶化条件を検討している.本課題で提案した摂氏100度の高温でタンパク質の結晶構造解析を行う手法を確立した.ただし,蛋白質試料の結晶化条件によっては結晶マウント法にも改良の余地があり,また温度因子で議論することの限界も明らかとなった.今後応用を進める中でさらに検討を行う.

1. The method is very reproducible, and it is possible to start with white crystals. The X-ray reflection intensity at room temperature and high temperature is very high. The temperature of the crystals was determined by microcalorimetry at 70 ° C. The X-ray generator used in the measurement room must be used before crystallization at high temperature. 2. This year's analysis is scheduled for the origin of the highly pathogenic bacterium Pyrococcus horikoshii, the quality of which is PH0670,PH1593. 3. Highly good thermal bacteria Pyrococcus horikoshii origin and quality PH0612(MinD) test. The temperature of the sample is above 70 ℃, and the high activity on the high temperature side is confirmed. PH0612 crystal, this research topic is to develop a crystal method, high temperature, good folding strength, high temperature, high temperature, high temperature. The main crystallization agent of MPD(2-mer-2,4-mer) of PH0612 is used to investigate the reasons for crystallization and the different crystallization conditions. This paper proposes to establish a method for analyzing the crystal structure of the crystal structure at a high temperature of 100 degrees Celsius. There is room for improvement in the crystallization conditions of protein samples, and the temperature factor is discussed. From now on, we will continue to discuss the future development of the industry.