時分割ラウエ法によるアミノ基転移酵素の反応機構の研究

本年度になって,高エネルギー加速器研究機構放射光研究施設の実験ステーションBL-18Bが,検出器をCCDに更新したことに伴ない白色X線での運用を停止した.このため,本研究で予定していた時間分割ラウエ法の実験を実施することが当面不可能となった.従って急遽,時間分割ラウエ法から単色X線による測定方法によって時分割実験を行う可能性を探ることに変更し,それが可能となる試料や方法の検討を行なった.このため,昨年度作製した単結晶用顕微分光装置にセルを付加し,溶液状態の試料の吸収スペクトルも測定可能に改造した.これを用いて,酵母由来のPLP酵素である1-aminocycropropane-1-carboxylate deaminase(ACCD)の吸収スペクトル変化をモニターしたところ,ACCDは溶液状態ではpH8.5付近で基質アナログであるL-AlaやL-Serと反応すると330nm付近の吸収ピークが増大することを観測した.これは,反応中間体のexternal aldmineで停止しているのではないかと推測し,この反応中間体を通常の単色X線を用いて構造解析することを目標とした.しかし,その結晶化条件には,拮抗阻害剤である硫酸アンモニウムが高濃度で含まれているため,結晶状態で基質アナログと反応させるために,別の結晶化条件を検討した.一方,Pyrococcus horikoshii由来のACCDにはアミノ基転移酵素活性があることが明かになり,今後はこれを用いて反応条件・測定条件を精密化し,単色X線利用時分割実験を進める.

本年度になって,高エネルギー加速器研究機構放射光研究施設の実験ステーションBL-18Bが,検出器をCCDに更新したことに伴ない白色X線での運用を停止した.このため,本研究で予定していた時間分割ラウエ法の実験を実施することが当面不可能となった.従って急遽,時間分割ラウエ法から単色X線による測定方法によって時分割実験を行う可能性を探ることに変更し,それが可能となる試料や方法の検討を行なった.このため,昨年度作製した単結晶用顕微分光装置にセルを付加し,溶液状態の試料の吸収スペクトルも測定可能に改造した.これを用いて,酵母由来のPLP酵素である1-aminocycropropane-1-carboxylate deaminase(ACCD)の吸収スペクトル変化をモニターしたところ,ACCDは溶液状態ではpH8.5付近で基質アナログであるL-AlaやL-Serと反応すると330nm付近の吸収ピークが増大することを観測した.これは,反応中間体のexternal aldmineで停止しているのではないかと推測し,この反応中間体を通常の単色X線を用いて構造解析することを目標とした.しかし,その結晶化条件には,拮抗阻害剤である硫酸アンモニウムが高濃度で含まれているため,結晶状態で基質アナログと反応させるために,別の結晶化条件を検討した.一方,Pyrococcus horikoshii由来のACCDにはアミノ基転移酵素活性があることが明かになり,今後はこれを用いて反応条件・測定条件を精密化し,単色X線利用時分割実験を進める.