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神経幹細胞への染色体部位特異的遺伝子組込み法の開発

开发神经干细胞染色体位点特异性基因整合方法

基本信息

批准号：
15659343
负责人：
岡田尚已
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

AAVの二つのコンポーネント(ITR配列とRep蛋白質)を利用し、第19番染色体長腕AAVS1領域に遺伝子を組み込ませる方法の応用開発を推進した。これまでにITR配列連結マーカー発現ユニットを構築し、切り出されたstuffer配列中のITRにRepが結合することによって、第19番染色体AAVS1領域に遺伝子組込みが生ずることを検討した。HeLa細胞を用いて、Southern blot解析によるAAVS1領域の遺伝子再構成とマーカー遺伝子のAAVS1領域特異的遺伝子組込み様式を確認した。さらに、ITR配列連結マーカー発現ユニットとRep発現誘導カセットを有するアデノウイルスベクターの応用を念頭に、アデノウイルスベクターの幹細胞への吸着を仲介するアダプター分子を開発した。アデノウイルスベクターに親和性のあるCARと幹細胞に発現するc-Kitのリガンド分子である幹細胞因子(SCF)を連結した、可溶性融合蛋白質CAR-SCFを構築し、その効果を検討した。CAR陰性c-Kit陽性の細胞株M07eへのeGFP発現Adベクター遺伝子導入(MOI 50)において、CAR-SCFを培養液に添加することでeGFP陽性率は0.5%から78%に向上した。ヒト臍帯血CD34^+細胞を用いた検討でも、9.8±3.7%から17.5±2.5%に改善された。CAR-SCFはc-Kit陽性細胞へのアデノウイルスベクター遺伝子導入効率を向上させ、これを用いた幹細胞へのAAVS1領域特異的遺伝子組込みへの応用が期待される。

The development of a method for the development of AAV DNA sequencing (ITR alignment and Rep protein) using the AAVS1 domain of chromosome 19 has been advanced. The ITR sequence is linked to the development of the gene. The ITR sequence in the stuffer sequence is linked to the development of the gene in the AAVS1 domain. HeLa cells were analyzed by Southern blot to confirm the AAVS1 domain specific gene composition of HeLa cells. In addition, ITR alignment links can be used to mediate stem cell uptake. C-Kit and Stem Cell Factor (SCF) are linked to soluble fusion protein CAR-SCF, and their effects on CAR stem cell development are discussed. CAR negative c-Kit positive cell line M07e showed eGFP expression when Ad vector was introduced (MOI 50) and CAR-SCF was added to the culture medium. The eGFP positive rate increased from 0.5% to 78%. CD34^+ cells in the umbilical cord blood were improved by 9.8±3.7% to 17.5±2.5% in the middle of the study. CAR-SCF is expected to improve the efficiency of gene introduction into c-Kit positive cells and AAVS1 domain-specific gene groups.