新規リウマチ関節炎抑制因子:FSTL1のリガンドのクローニングとその機能の解析

新型类风湿关节炎抑制剂：FSTL1配体的克隆及其功能分析

• 批准号: 16659264
• 负责人: 田中 真生
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659264/
• 关键词: 関節リウマチ; ホリスタチン関連蛋白; two-hybrid法; クローニング

FRPの受容体を含めたリガンドのクローニングは,ヒトFRPをbaitとし,前回の実験でFRPが心臓で高発現していた理由より,ヒト心臓由来のcDNAライブラリーをpreyとして,酵母のtwo-hybrid法を用いて行った.クローニングしたcDNAを酵母に再導入し,FRPとの相互作用を確認した結果,重複したクローンを除く10クローンのうち,4クローン:A7,A45,A94,C63が残った.塩基配列解析より,A7は未知タンパク,A45はCD14,A94はヘパラン硫酸プロテオグリカンの中核タンパクであるglypican 1,C63は横紋筋細胞に豊富な巨大繊維性タンパクtitin(connectin)をコードしていた.このうち,A7は未知タンパクであり,構造予想より膜タンパクと考えられたため,5'RACE法により全長6,981bpをクローニングし再構築した.A7の全長cDNA産物は,N末端が細胞質内でC末端が細胞外にあり,3つの膜通過部位を有する膜タンパクであり,N末端にAMP結合部位があることが予想された.A7はRT-PCRでヒト滑膜細胞株SF-1で発現が確認された.glypican 1とCD14は,それぞれendostatinとLPSおよびLPS結合タンパク(LBP)の受容体として知られる.FRPはこれらのタンパクと相互作用する可能性があるが,未知の受容体タンパクであるA7がFRPの特異的受容体であると考えた.このことを確認するため,C末にFLAGタグをコードするA7cDNAをdoxycycline(Dox)制御発現ベクターに入れたpTRE-Tight-A7およびその制御ベクターpTet-Onを滑膜細胞株SF-1に導入しTetOn-SF-1/A7を樹立した.このTetOn-SF-1/A7にDox, FRPおよび抗FLAG抗体Fabを添加し,FRPのシグナル伝達の効果としてc-Fosの発現を定量した.TetOn-SF-1/A7にDoxを添加すると,誘導A7のためFRPのc-Fos抑制作用が増強され,この増強は抗FLAG抗体Fabで阻害された.よってFRPのc-Fos抑制シグナルは主としてA7によって伝達されると考え,A7がFRPの受容体,FRPRと結論した(投稿準備中).また追加実験として、BIACOREを用いてA7とFRPの親和力を定量しているところである.

FRP receptor contains a variety of different types of protein, such as protein, protein The cDNA was reintroduced into yeast, and the interaction between FRP and yeast was confirmed. The results were repeated, except for the 10 cDNA fragments, 4 cDNA fragments:A7,A45,A94,C63. A7 is unknown,A45 is CD14,A94 is unknown,C63 is unknown, C64 is unknown,C63 is unknown, C64 is unknown, C65 is unknown, C65 is unknown, A75 is unknown, A75 is unknown, A75 A7 cDNA was reconstructed by 5 'RACE method with 6, 981bp in length. The N-terminal end of A7 cDNA was isolated from the cytoplasm and the C-terminal end of A7 cDNA was isolated from the cytoplasm. The N-terminal AMP-binding site was identified by RT-PCR in synovial cell line SF-1.Glypican 1 and CD14 were identified by RT-PCR in synovial cell line SF-1. Endostatin and LPS were identified by RT-PCR in synovial cell line SF-1. FRP was identified by the possibility of interaction between LPS and endostatin in synovial cell line SF-1. FRP was identified by RT-PCR in synovial cell line SF-1. This was confirmed by the introduction of doxycycline(Dox) gene into the pTRE-Tight-A7 and pTet-On synovial cell line SF-1, and the establishment of TetOn-SF-1/A7. The addition of Dox, FRP and anti-FLAG Fab to TetOn-SF-1/A7 resulted in the quantification of c-Fos inhibition induced by FRP. The addition of Dox to TetOn-SF-1/A7 induced an increase in c-Fos inhibition induced by FRP and anti-FLAG Fab. Fos inhibition of FRP is the main reason for this. A7 is the receptor of FRP. FRPR is the conclusion (in preparation). Add BIACORE to A7 and FRP to quantify affinity.

项目成果

関節リウマチの成因と病態生理 1.概論2)自己免疫異常

类风湿性关节炎的病因和病理生理学 1. 概述 2) 自身免疫异常

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日本臨床 63・S1
• 作者: Yoshifuji;H.;Umehara;H.;Maruyama;H.;Itoh;M.;Tanaka;M.;Kawabata D.;Fujii;T.;Mimori;T.;田中 真生
• 通讯作者: 田中 真生

関飾リウマチの検査・診断7.免疫・血清学的検査1)概論

关西风湿病的检查和诊断 7. 免疫学和血清学检查 1) 概述

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日本臨床 63(S1)
• 作者: Yoshifuji;H.;Umehara;H.;Maruyama;H.;Itoh;M.;Tanaka;M.;Kawabata D.;Fujii;T.;Mimori;T.;田中 真生;田中 真生;田中 真生;田中 真生;田中 真生
• 通讯作者: 田中 真生

関節リウマチの成因と病態生理1.概論2)自己免疫異常

类风湿性关节炎的病因和病理生理学 1. 概述 2) 自身免疫异常

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日本臨床 63(S1)
• 作者: Yoshifuji;H.;Umehara;H.;Maruyama;H.;Itoh;M.;Tanaka;M.;Kawabata D.;Fujii;T.;Mimori;T.;田中 真生;田中 真生;田中 真生;田中 真生
• 通讯作者: 田中 真生

RA関連抗体(抗カルパスタチン抗体,抗gp130-RAPS抗体,抗FRP抗体)

RA相关抗体（抗calpastatin抗体、抗gp130-RAPS抗体、抗FRP抗体）

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日本臨床 63・S7
• 作者: Yoshifuji;H.;Umehara;H.;Maruyama;H.;Itoh;M.;Tanaka;M.;Kawabata D.;Fujii;T.;Mimori;T.;田中 真生;田中 真生;田中 真生
• 通讯作者: 田中 真生

Amelioration of experimental arthritis by a calpain-inhibitory compound:: regulation of cytokine production by E-64-d in vivo and in vitro

• DOI: 10.1093/intimm/dxh311
• 发表时间: 2005-10-01
• 期刊: INTERNATIONAL IMMUNOLOGY
• 影响因子: 4.4
• 作者: Yoshifuji, H;Umehara, H;Mimori, T
• 通讯作者: Mimori, T