内皮系超低増殖細胞によるライ菌の長期体外培養法の樹立

昨年度、超低増殖細胞(SLG細胞)の培養条件の設定温度として、34℃と報告した。しかし、ライ菌の組織内最適増殖温度条件が30〜27℃とされていることから、さらにライ菌の温度条件にあったSLG細胞の最適培養温度条件を検討した。SLG細胞は28℃にすると、細胞増殖はほぼ停止状態になった。細胞数の倍加時間は5000時間を超えた。細胞は一部ヒトデ型に変形するが、剥離や細胞融解を起こすことはなかった。この28℃はライ菌組織内最適増殖温度条件の30〜27℃の範囲内であり、ライ菌、SLG細胞双方にとって最適条件と考えられる。今年度の研究予定であった、SLG細胞内ライ菌の増菌を確認するための経時的SLG細胞内菌数、Shepard法による菌数とATP値は正確な値が計測できなかった。理由はライ球を障害せず単菌にして各細胞に均一に感染させられなかったためで、菌数を測定することができなかった。Shepard法による分離菌数やATPの測定は出来ているが、分離中の菌のロスが多く、安定したデータとはならなかった。ライ菌の分離手技向上は今後の課題として残された。上記の方法に代えて生菌として増殖している確証を得るために、ライ菌特異的16S rRNA primier P2,P3を用いたcomparative RT-PCRによるRNAの比較定量を行った。この結果、4ヶ月の培養期間中にRNAが約8倍に増加した。この結果からライ菌のSLG細胞内での増殖倍加時間は約14日前後と推察された。分離菌のマウスフットパッドへの接種実験は菌数的に十分採取できなかったことから、まだ明らかな足底の腫脹は見られていない。上記の最適培養温度28℃が設定されたことで、分離菌のSLG細胞への継代感染には成功しており、2回の継代で現在、感染実験の最長は8ヶ月に達し、さらに培養は継続されている。

昨年度、超低増殖細胞(SLG細胞)の培養条件の設定温度として、34℃と報告した。しかし、ライ菌の組織内最適増殖温度条件が30〜27℃とされていることから、さらにライ菌の温度条件にあったSLG細胞の最適培養温度条件を検討した。SLG細胞は28℃にすると、細胞増殖はほぼ停止状態になった。細胞数の倍加時間は5000時間を超えた。細胞は一部ヒトデ型に変形するが、剥離や細胞融解を起こすことはなかった。この28℃はライ菌組織内最適増殖温度条件の30〜27℃の範囲内であり、ライ菌、SLG細胞双方にとって最適条件と考えられる。今年度の研究予定であった、SLG細胞内ライ菌の増菌を確認するための経時的SLG細胞内菌数、Shepard法による菌数とATP値は正確な値が計測できなかった。理由はライ球を障害せず単菌にして各細胞に均一に感染させられなかったためで、菌数を測定することができなかった。Shepard法による分離菌数やATPの測定は出来ているが、分離中の菌のロスが多く、安定したデータとはならなかった。ライ菌の分離手技向上は今後の課題として残された。上記の方法に代えて生菌として増殖している確証を得るために、ライ菌特異的16S rRNA primier P2,P3を用いたcomparative RT-PCRによるRNAの比較定量を行った。この結果、4ヶ月の培養期間中にRNAが約8倍に増加した。この結果からライ菌のSLG細胞内での増殖倍加時間は約14日前後と推察された。分離菌のマウスフットパッドへの接種実験は菌数的に十分採取できなかったことから、まだ明らかな足底の腫脹は見られていない。上記の最適培養温度28℃が設定されたことで、分離菌のSLG細胞への継代感染には成功しており、2回の継代で現在、感染実験の最長は8ヶ月に達し、さらに培養は継続されている。