糞便中の癌細胞由来微量変異APC検出による新しい大腸癌診断法開発

通过检测粪便中少量癌细胞衍生的APC突变开发新的结直肠癌诊断方法

• 批准号: 16659357
• 负责人: 岡島 正純
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659357/
• 关键词: 大腸癌; 糞便検査; APC; 酵母; URA3; 5FOA培地

(A)URA3+vectorの構築URA3遺伝子をpRS-GALl-MYC-BSという酵母用vectorに組み込み、Direct sequenceにより塩基配列の確認を行なった。次いで、酵母内での発現を確認するために当初の予定通りwestern blotを行いURA3タンパクの発現を確認した。機能面での確認のためURA3(+)vectorを導入した酵母を5FOA培地に散布したところ予定通り、酵母の増殖は認めなかった。(B)APC遺伝子の組み込みのコントロール実験SW480細胞株(ヒト大腸癌由来細胞株)、健常人リンパ球から抽出したDNAを元にAPC (adenomatous polyposis coli)のMCR (mutation cluster region)をPCRを用いて増幅させ、それぞれ変異APC、正常APCとして、(A)で作製したURA3(+)vectorに組み込んだ。(A)と同様にDirect sequenceで塩基配列の確認を行い、western blotでURA3タンパクの発現を確認した。また、変異APC、正常APCを組み込んだvectorを、それぞれ導入した酵母を5FOA培地に散布したところ予想通り正常APCを組み込んだものでは酵母の増殖は認めず、変異APCを組み込んだものでのみ増殖を認めた。(C)臨床検体を用いた便からのDNA抽出とAPC遺伝子の組み込み実験ヒト便からのDNA抽出を行なった後、APC遺伝子MCRのPCRを行なったところ、便中に含まれるPCR阻害物質により目的遺伝子の増幅が困難であった。条件設定の変更、プライマーの変更などを繰り返し、安定した増幅が望めるようになった。しかしAPCを(A)で作製したURA3(+)vectorに組み込む際、その導入効率が低く、このままでは臨床応用に耐えられないと判断した。導入効率向上のため、vectorの変更やAPCを組み込むサイトの変更など様々な工夫を行なっている。

Traces of URA3 + (A) the vector の build URA3 伝 son を pRS - GALl - MYC - BS と い う yeast using the vector group に み 込 み, Direct sequence に よ り salt base line with column の confirm を な っ た. Within time い で, yeast で の 発 を now confirm す る た め に の original designated general り western blot を line い URA3 タ ン パ ク の 発 を now confirm し た. Function surface で の confirm の た め URA3 (+) vector を import し を 5 foa た yeast culture to spread に し た と こ ろ designated り and yeast の raised colonization は recognize め な か っ た. Group (B) the APC heritage 伝 son の み 込 み の コ ン ト ロ ー ル be 験 SW480 cell line (ヒ ト origin colorectal cancer cell lines), the healthy normal リ ン パ ball か ら spare し た DNA を yuan に APC (adenomatous polyposis coli) の MCR (mutation cluster Region) を PCR を い て rights of さ せ, そ れ ぞ れ - different APC, normal APC と し て, (A) で cropping し た URA3 (+) vector group に み 込 ん だ. With others (A) と に Direct sequence で salt base line column の confirm を い, western blot で URA3 タ ン パ ク の 発 を now confirmed し た. ま た, - different APC, normal APC を み 込 ん だ vector を, そ れ ぞ れ import し を 5 foa た yeast culture to spread に し た と こ ろ to think り normal APC を み 込 ん だ も の で は yeast の raised colonization は recognize め ず group, - different APC を み 込 ん だ も の で の み raised colonization を recognize め た. (C) clinical を 検 body with い た then か ら の DNA extraction と APC heritage 伝 son の group み 込 み be 験 ヒ ト then か ら の DNA extraction line を な っ た after, APC but 伝 MCR の PCR line を な っ た と こ ろ, feces has に containing ま れ る PCR resistance against material に よ り purpose heritage 伝 son の rights of が difficult で あ っ た. The conditions are set for <s:1> change, プラ プラ を <s:1> change な な <s:1> change な を を return to <s:1>, stability た increase が hope めるようになった. し か し APC を で cropping (A) し た URA3 (+) vector group に み 込 む interstate, そ の import working rate low が く, こ の ま ま で は clinical 応 resistance with に え ら れ な い と judgment し た. Import services rate upward の た め, vector の - more や APC を group み 込 む サ イ ト の - more な ど others 々 な time line を な っ て い る.