骨再生を目指した転写因子Osterixの機能調節機構の解明

昨年度に引き続き、Osterix転写活性化領域の詳細を同定するために、GAL4-binding sitesと連接させたルシフェラーゼreporter plasmidを用いたGal4融合システムレポーター分析を行い、Osterixの転写活性を調べた。その結果、Osterixの転写活性領域がプロリンとグリシン残基に富んでおり、哺乳類とイーストの細胞における活性の特性を持っていることを認めた。GST-pull down分析および免疫沈降法では、TBPではなく、基本転写因子であるTF-IIBが転写活性領域に結合することを示した。さらに、Osterix相互作用因子を探索するために、FLAG-tagを付加したOsterix発現plasmidを培養細胞に導入し、αFLAG抗体を用いた免疫沈降法を行ったところ、in vivoとin vitroにおいて、OsterixがそのC末端Zinc-Finger領域を通して、クロマチンリモデリング因子Brg-1および癌抑制遺伝子p53と相互作用することを見つけた。Osterixにより発現制御される遺伝子群の検索するために、G418耐性遺伝子を有したOsterix発現plasmidを作製し、薬剤選択によりOsterix遺伝子をstableに過剰発現するSaOS2細胞を樹立し、その遺伝子発現について解析した。RT-PCR法により骨芽細胞特異的遺伝子群の発現について検討したところ、Osterix導入により、親株のSaOS2細胞に比べてオステオカルシンmRNAの亢進が確認できたが、アルカリ性ホスファターゼmRNAの発現には影響がみられなかった。さらに、網羅的遺伝子発現解析を行った結果、Osterix導入により発現亢進また抑制される遺伝子が多数検出された。

昨年度に引き続き、Osterix転写活性化領域の詳細を同定するために、GAL4-binding sitesと連接させたルシフェラーゼreporter plasmidを用いたGal4融合システムレポーター分析を行い、Osterixの転写活性を調べた。その結果、Osterixの転写活性領域がプロリンとグリシン残基に富んでおり、哺乳類とイーストの細胞における活性の特性を持っていることを認めた。GST-pull down分析および免疫沈降法では、TBPではなく、基本転写因子であるTF-IIBが転写活性領域に結合することを示した。さらに、Osterix相互作用因子を探索するために、FLAG-tagを付加したOsterix発現plasmidを培養細胞に導入し、αFLAG抗体を用いた免疫沈降法を行ったところ、in vivoとin vitroにおいて、OsterixがそのC末端Zinc-Finger領域を通して、クロマチンリモデリング因子Brg-1および癌抑制遺伝子p53と相互作用することを見つけた。Osterixにより発現制御される遺伝子群の検索するために、G418耐性遺伝子を有したOsterix発現plasmidを作製し、薬剤選択によりOsterix遺伝子をstableに過剰発現するSaOS2細胞を樹立し、その遺伝子発現について解析した。RT-PCR法により骨芽細胞特異的遺伝子群の発現について検討したところ、Osterix導入により、親株のSaOS2細胞に比べてオステオカルシンmRNAの亢進が確認できたが、アルカリ性ホスファターゼmRNAの発現には影響がみられなかった。さらに、網羅的遺伝子発現解析を行った結果、Osterix導入により発現亢進また抑制される遺伝子が多数検出された。