好塩基球細胞内シグナルを利用した新しいアレルギー診断用細胞チップの開発

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(1)モデルアレルゲンとしてDNP-BSAを作成した。好塩基球細胞株RBL-2H3にラット抗DNP抗体(IgE)を結合させた細胞表面にDNP-BSAが結合することを確認した。(2)カルシウム指示薬Fluo-3で染色したRBL-2H3をBAM表面上に固定化し、この固定化操作刺激で細胞内カルシウムに変化が見られないことを確認した。その後、A23187をこの固定化細胞に与えると、細胞内カルシウム濃度上昇が確認でき、BAM表面上に固定化しただけでは細胞内カルシウム変化を惹き起こさない事を確認した。(3)BAM上に固定化したRBL-2H3にラット抗DNP抗体(IgE)を感作し、DNP-BSA(10μg/ml)を与えたところ、細胞内カルシウム濃度変化を示す細胞内蛍光の上昇が刺激1分後に1.5-2倍程度見られた。最低感度はDNP-BSA3μg/mlであった。対照に培養皿に一晩培養して自然に接着させたRBL-2H3細胞とも比較したが、ほぼ同様な結果が得られ、固定化細胞は自然に接着した細胞と同様にアレルギーテストに用いることができることがわかった。(4)マイクロ流路を作成した。流路幅200μm、高さ150μm、流路長約2cmのPDMSで作成した直線流路で、酸素プラズマ処理した流路の底部に0.17mm厚のカバーガラスを貼り付けた。マイクロ流路内にRBL-2H3細胞懸濁液を注入し、室温で20分後に細胞が流路に良好に固定できた。(5)流路内に固定化した細胞にIgE感作とFluo-3染色を施し、DNP-BSA(10μg/ml)を与えたとき、(3)の結果同様な結果が得られた。更に個々の細胞ごとに蛍光変化を調べた結果、蛍光変化が3-4倍と大きく変化したものや、蛍光ピーク時間が細胞によって異なっていることがわかり、個々の細胞毎にアレルゲンへの反応性を測定することが真の細胞応答を調べることとなることが示唆できた。