ゴルジ体抽出画分による糖修飾の再構築

使用高尔基体提取物组分重建糖修饰

• 批准号: 17657048
• 负责人: 佐藤 利行
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Mitsubishi Kagaku Institute of Life Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17657048/
• 关键词: Saccharomyces cerevisiae; 糖鎖修飾; in vivo; ゴルジ体; 小胞輸送; 膜タンパク質; 糖修飾

糖タンパク質の性質や活性を試験管内で測定するには、合成した蛋白質に正しい糖鎖を付加する必要がある。小胞体で翻訳されたタンパク質はゴルジ体へと小胞輸送され、順序よく糖が付加される。しかし、試験管内で糖鎖を制御しながら付加する技術は発展途上であり、本研究では一連の反応を試験管内で再現し、「試験管内で任意の糖鎖を付加する技術」を開発する。昨年度は、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの生体より小胞体膜画分やゴルジ体膜画分、可溶性画分を抽出する方法を確立した。さらにそれらを用いて、試験管内での標的タンパク質の糖修飾系を確立した。本年度は、試験管内での糖修飾反応系の検証をさらに行った。試験管内で反応を起こし、糖修飾による標的タンパク質の高分子化を明確にするために、S.cerevisiaeのN型糖鎖合成の初期反応に関与する糖転移酵素複合体M-PolIのサブユニットの1つ、Vanlpをコードする遺伝子(van1)を破壊したS.cerevisiaeを形質転換し、相同組換えにより標的タンパク質を高発現するvan1破壊株を作製した。その破壊株から小胞体膜画分を抽出した。その小胞体中には、N型糖鎖が成熟型より短く付加された標的タンパク質が存在した。この小胞体画分と、野生株から別々に抽出したゴルジ体画分および可溶性画分を試験管内で混合し小胞輸送を起こした。結果、標的タンパク質が高分子化されたことをSDS-PAGE上で確認し、試験管内で糖鎖修飾されたと示唆された。しかし、SDS-PAGE上で検出された高分子化は、野生株における成熟型標的タンパク質の見かけ分子量よりも大きいものであった。反応により糖修飾された標的タンパク質の分子量は、野生株における成熟型標的タンパク質の分子量と等しくなるとの予想とは反するものであり、試験管内において糖鎖修飾を制御するためには、細胞におけるさらなる糖鎖伸長決定機構の解明が必要であると示唆された。

The activity of glucose was measured in the tube, and the synthetic protein was added to the necessary sugar. The small cell body is full of sugar, sugar and sugar. In this study, the production of any kind of sugar in the tube will be repeated in the exhibition of the technology exhibition, and the technology will be available again. Last year, Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, small cell membrane painting, body membrane painting, soluble painting, extraction, extraction and determination. Please make sure that the sugar repair system is properly installed. This year, the department of sugar repair and anti-sugar repair in the tube is in good condition. In the tube, the chemical reaction, the sugar repair, the high molecular weight, the initial synthesis of S-cerevisiaeN-type sugar, the early synthesis of M-PolI and the complex of sugar transferase, M-PolI, S.cerevisiae, van1, and so on, were detected. In the same group, we can see that the broken strain of van1 can be used as an antivirus. The small cell membrane was drawn and extracted from the broken plant. In the small cell body, N-type sugar, mature type, short-term, long-term, long- The small cells are divided, the wild plants are drawn, the bodies are drawn, the soluble pictures are separated, and the mixed cells are sent to each other in the tube. Results: the results showed that the high molecular weight was confirmed on the SDS-PAGE, and the sugar in the tube was modified. Molecular weight, molecular weight and molecular weight. In order to determine the molecular weight, the molecular weight.