金属結合タンパク質を用いた電子顕微鏡で観察できる1分子ラベリングの研究

使用金属结合蛋白可通过电子显微镜观察的单分子标记的研究

基本信息

项目摘要

本研究は、電子顕微鏡で観察可能な細胞内分子標識法を開発することを目的とした。昨年度は、金属結合タンパク質であるメタロチオネイン(MT)3分子をラベルとして標的タンパク質であるPSD-95に融合させ(PSD-95-3MT)、Cd^<2+>と結合させたタンパク質を電子顕微鏡で黒い粒として確認した。本年度は、この標識タンパク質の細胞内での観察を試みた。まず、添加するCd^<2+>が細胞毒性を示さない濃度と添加時間を決定した。同時に海馬初代培養細胞での発現効率が高いアデノウイルス(AdPSD-95-3MT)を用いた遺伝子導入系を確立した。Cd^<2+>を結合したPSD-95-3MT由来のコントラストを見逃さず捉えるために、細胞は重金属等による染色を行わない状態でPSD-95-3MTを高発現した神経細胞を電子顕微鏡で観察した。その結果、細胞内に黒い塊が多数認められた。無処置、AdPSD-95-3MT処置のみ、またはCd^<2+>処置のみの神経細胞では、このような黒い塊は認められなかった。以上の結果より、細胞内で発現しCd^<2+>を結合したPSD-95-3MTは、電子顕微鏡で観察することが可能であることが分かった。次に、3MTとの融合がPSD-95のシナプスに集積する性質や、NMDA受容体NR2Bサブユニット、Kv1.4および神経型一酸化窒素合成酵素と結合する性質に及ぼす影響について検討した。その結果、PSD-95-3MTはPSD-95と同様に、シナプスに集積し、本来の結合パートナーと結合できることが確認できた。こうして、標的タンパク質に融合させた金属結合タンパク質による金属クラスターが、ラベルとして使用できるかどうかの実証的な実験を行い、電子顕微鏡法における新規の分子標識手法として確立できた。これらの結果を2報にまとめ、Journal of Electron Microscopyに投稿中である。
The purpose of this research is to develop a method for detecting intracellular molecular markers using electronic microscopes. Last year, the metal binding agent (MT)3 molecules were identified by electron microscopy. This year, we will try to detect the intracellular changes in the quality of the products. The concentration and time of addition of Cd^<2+> for cytotoxicity determination At the same time, the survival rate of hippocampal primary culture cells was high, and AdPSD-95- 3MT was used to establish the vector introduction system. PSD-95 - 3MT is highly visible in cells stained with heavy metals such as Cd <2+> and its origin is detected by electron microscopy. The result is that most of the cells are black and white. No treatment, AdPSD-95- 3MT treatment, no treatment. The above results show that the combination of Cd^<2+> found in cells and the PSD-95- 3MT makes it possible to observe it with an electronic microscope. In addition, the fusion of PSD-95 and NMDA receptor NR2B was studied in terms of the properties and effects of NMDA receptor NR2B and NMDA receptor Kv1.4 on the binding of neuro-acid synthase. The PSD-95- 3MT is the same as PSD-95, and the original combination of PSD-95 - 3MT is the same as PSD-95. The new molecular identification method was established by electron microscopy. The results were reported in the Journal of Electron Microscopy.

项目成果

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