金属結合タンパク質を用いた電子顕微鏡で観察できる1分子ラベリングの研究

使用金属结合蛋白可通过电子显微镜观察的单分子标记的研究

• 批准号: 17657053
• 负责人: 宮澤 淳夫
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17657053/
• 关键词: 電子顕微鏡; 細胞内分子標識法; メタロチオネイン; カドミウム; PSD-95; アデノウイルス; シナプス; 金属結合蛋白質; 分子イメージング; 1分子計測; 分子ラベリング

本研究は、電子顕微鏡で観察可能な細胞内分子標識法を開発することを目的とした。昨年度は、金属結合タンパク質であるメタロチオネイン(MT)3分子をラベルとして標的タンパク質であるPSD-95に融合させ(PSD-95-3MT)、Cd^<2+>と結合させたタンパク質を電子顕微鏡で黒い粒として確認した。本年度は、この標識タンパク質の細胞内での観察を試みた。まず、添加するCd^<2+>が細胞毒性を示さない濃度と添加時間を決定した。同時に海馬初代培養細胞での発現効率が高いアデノウイルス(AdPSD-95-3MT)を用いた遺伝子導入系を確立した。Cd^<2+>を結合したPSD-95-3MT由来のコントラストを見逃さず捉えるために、細胞は重金属等による染色を行わない状態でPSD-95-3MTを高発現した神経細胞を電子顕微鏡で観察した。その結果、細胞内に黒い塊が多数認められた。無処置、AdPSD-95-3MT処置のみ、またはCd^<2+>処置のみの神経細胞では、このような黒い塊は認められなかった。以上の結果より、細胞内で発現しCd^<2+>を結合したPSD-95-3MTは、電子顕微鏡で観察することが可能であることが分かった。次に、3MTとの融合がPSD-95のシナプスに集積する性質や、NMDA受容体NR2Bサブユニット、Kv1.4および神経型一酸化窒素合成酵素と結合する性質に及ぼす影響について検討した。その結果、PSD-95-3MTはPSD-95と同様に、シナプスに集積し、本来の結合パートナーと結合できることが確認できた。こうして、標的タンパク質に融合させた金属結合タンパク質による金属クラスターが、ラベルとして使用できるかどうかの実証的な実験を行い、電子顕微鏡法における新規の分子標識手法として確立できた。これらの結果を2報にまとめ、Journal of Electron Microscopyに投稿中である。

这项研究旨在开发一种可以通过电子显微镜观察到的细胞内分子标记方法。去年，将三种金属结合蛋白金属硫硫代硫蛋白（MT）分子融合到靶蛋白PSD-95（PSD-95-3MT）中，作为标签，与CD^<2+>结合的蛋白质被确认为电子显微镜下的黑色颗粒。今年，我们试图在细胞内观察这种标记的蛋白质。首先，添加的CD^<2+>的浓度不是细胞毒性的，并确定了添加时间。同时，使用腺病毒（ADPSD-95-3MT）建立了基因转移系统，该腺病毒在原发性海马培养细胞中具有较高的表达效率。为了捕获与CD^<2+>结合的PSD-95-3MT得出的对比度，而不会忽略，在电子显微镜下观察到细胞，而没有用重金属或类似的神经元染色，其神经元具有很高的PSD-95-95-3MT。结果，在细胞中发现了许多黑色肿块。在没有治疗的神经元中，单独使用ADPSD-95-3MT或CD^<2+>的神经元中未观察到这种黑色肿块。从上述结果中可以发现，在电子显微镜下可以观察到在细胞中表达并与Cd^<2+>结合的PSD-95-3MT。接下来，我们研究了与3MT融合对PSD-95的突触积累及其与NMDA受体NR2B亚基，KV1.4和神经一氧化氮合酶的结合的影响。结果，已经证实，类似于PSD-95的PSD-95-3MT在突触处积聚，并可以与其原始结合伙伴结合。因此，已经进行了经验实验，以确定是否可以将融合到靶蛋白的金属结合蛋白的金属簇用作标签，并已确定为电子显微镜中的一种新型分子标记方法。这些结果总结在两份报告中，目前已发布在《电子显微镜杂志》中。