ピロリ菌発現ベクターを利用した病原性毒素の生細胞モニタリング解析

H.pyloriの標準株ATCC43504からDNAを抽出し、Cag A, Vac Aの全長の遺伝子をPCRで増幅してクローニングし、シークエンスで確認した。よく知られているように、H.pyloriに株ごとにCag A, Vac Aの塩基変異が多く存在し、これが病原性と深い関係がある。特に、Cag Aのチロシンリン酸化部位のリピートの数は重要で、標準株ATCC43504の場合は5回と最も多い方に属しており、病原性の強い性質を備えているものと推測される。Cag Aのチロシンを含む繰り返し配列部位は上皮細胞に注入された後に、細胞内のリン酸化蛋白でチロシン残基がリン酸化され、これによって細胞内にシグナル伝達が開始され、サイトカインなどの起炎分子の誘導が起こるとされている。Cag A遺伝子をFLAGを含む発現ベクターとGFPを含む発現ベクターに組み込んで、まずHEK293T, AGSなどの培養細胞内での発現を観察した。次に、TagつきのCag A遺伝子をshuttle vectorであるH.pylori発現ベクター(pHel3)に組み込んで大腸菌でまず発現させ、抗生物質で選択した後に、H.pyloriに遺伝子導入した。Tagがあるかないかで、内因性Cag Aと強制発現したCag Aを区別した。そして、Cag Aを導入したH.pyloriは抗生剤によって選択した。このTagつきCag A導入H.pyloriをAGSに感染させたところ、遺伝子操作のないH.pyloriと同様なハミングバードと言われる変化を示した。

H.pyloriの標準株ATCC43504からDNAを抽出し、Cag A, Vac Aの全長の遺伝子をPCRで増幅してクローニングし、シークエンスで確認した。よく知られているように、H.pyloriに株ごとにCag A, Vac Aの塩基変異が多く存在し、これが病原性と深い関係がある。特に、Cag Aのチロシンリン酸化部位のリピートの数は重要で、標準株ATCC43504の場合は5回と最も多い方に属しており、病原性の強い性質を備えているものと推測される。Cag Aのチロシンを含む繰り返し配列部位は上皮細胞に注入された後に、細胞内のリン酸化蛋白でチロシン残基がリン酸化され、これによって細胞内にシグナル伝達が開始され、サイトカインなどの起炎分子の誘導が起こるとされている。Cag A遺伝子をFLAGを含む発現ベクターとGFPを含む発現ベクターに組み込んで、まずHEK293T, AGSなどの培養細胞内での発現を観察した。次に、TagつきのCag A遺伝子をshuttle vectorであるH.pylori発現ベクター(pHel3)に組み込んで大腸菌でまず発現させ、抗生物質で選択した後に、H.pyloriに遺伝子導入した。Tagがあるかないかで、内因性Cag Aと強制発現したCag Aを区別した。そして、Cag Aを導入したH.pyloriは抗生剤によって選択した。このTagつきCag A導入H.pyloriをAGSに感染させたところ、遺伝子操作のないH.pyloriと同様なハミングバードと言われる変化を示した。