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安定なRNA干渉を可能にするステーブル細胞株作製技術の開発

开发可实现稳定RNA干扰的稳定细胞系生产技术

基本信息

批准号：
17659111
负责人：
福重真一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659111/
关键词：
発現制御遺伝子部位特異的組換え Cre RNA干渉

项目摘要

本研究ではCre-lox遺伝子挿入系を用い、ゲノム上の特定部位(前もって導入したlox部位)に二本鎖のsiRNAを発現するコンストラクトを正確に単一コピー挿入することによって、確実にRNA干渉をおこなう細胞株の作製を目的とした。本年度は、Ltk-細胞に単一コピーのlox位を含む細胞株、73-14を用い、マウスRet finger protein (RFP)に対するRNA干渉コンストラクトをCre-lox遺伝子挿入系により導入したステーブル細胞株を作製し、その効果を解析した。まず、73-14にRFPのRNA干渉コンストラクトを含むloxターゲティングベクターとCre発現プラスミドをトランスフェクションし、G418での薬剤選択により14個の組換え体を得た。これらの組換え体からゲノムDNAを抽出し、種々のPCRで組換え部位、RNA干渉コンストラクトの存在を確認した。次に、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローンすべてがゲノム中のlox部位に正確にRFPのRNA干渉コンストラクトをもつことを確認した。さらに、ターゲティングベクター中のCMVプロモーターをプローブとしサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローン中、11クローンが単一コピーの組換え体であり、残り3クローンは2コピー以上の組換え体であることが判明した。ウエスタンブロティング法により14クローンのRFP干渉による蛋白レベルでの変化を解析した結果、どのクローンでも親株に比べ約50%のノックダウンが観察された。興味深いことにRNA干渉コンストラクトを2コピー以上もつ3個の組換え体でも単一コピーをもつ残り11個の組換え体とノックダウン率に大きな違いが見出せなかった。このことは、コピー数よりもRNA干渉を引き起こすshRNAの塩基配列を変える方がより効果的にRNA干渉をおこなえる可能性を示すと考えられる。

In this study, the Cre-lox legacy insertion system was used, and the specific site of the Cre-lox insertion system (previous introduction of the lox site) and the siRNA of the second lock were used.発appearするコンストラクトをcorrectに単一コピーinsertすることによって、The purpose of the production of the RNA stem cell line is the とした. This year's は, Ltk-cell に単一コピーのlox bit をcontaining む cell line, 73-14 をい, マウスRet finger protein (RFP) に対するRNA stem コンストラクトをCre-lox legacy insertion system により introduced したステーブル cell line を production し, その effect を analysis した.まず、73-14にRFPのRNA干渉コンストラクトをcontains むloxターゲティングベクターとCrプラスミドをトランスフェクションし, G418 での薬剤选択により 14 pieces of the set can be exchanged. Extraction of DNA from the body, PCR, replacement of parts, and confirmation of the existence of RNA stem cells. Tsuna, Nichiru's patience legacy をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローンすべてがゲノム中のlox partsにcorrectにRFPのRNA干渉コンストラクトをもつことをconfirmedした.さらに、ターゲティングベクター中のCMVプロモーターをプローブとしサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローン中, 11クローンが単一コピーの合え体であり, residual 3 クローンは2 コピー or above group change えbody であることが clarification した.ウエスタンブロティング法により14クローンのRFP 干渉によるprotein レベルでの剉化The result of analysis is about 50% of the parent strain's ratio. Interesting and deep taste of RNA stemsコピーをもついり11 pieces of set change body とノックダウン rate に大きなviolation いが见出せなかった.このことは、コピーnumber よりもRNA 干渉を cited き出こすshRNAの塩组arrayをThe possibility of the にRNA 干渉をおこなえる effect of the 変える方がより is shown by the すと考えられる.