安定なRNA干渉を可能にするステーブル細胞株作製技術の開発

开发可实现稳定RNA干扰的稳定细胞系生产技术

• 批准号: 17659111
• 负责人: 福重 真一
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659111/
• 关键词: 発現制御; 遺伝子; 部位特異的組換え; Cre; RNA干渉

本研究ではCre-lox遺伝子挿入系を用い、ゲノム上の特定部位(前もって導入したlox部位)に二本鎖のsiRNAを発現するコンストラクトを正確に単一コピー挿入することによって、確実にRNA干渉をおこなう細胞株の作製を目的とした。本年度は、Ltk-細胞に単一コピーのlox位を含む細胞株、73-14を用い、マウスRet finger protein (RFP)に対するRNA干渉コンストラクトをCre-lox遺伝子挿入系により導入したステーブル細胞株を作製し、その効果を解析した。まず、73-14にRFPのRNA干渉コンストラクトを含むloxターゲティングベクターとCre発現プラスミドをトランスフェクションし、G418での薬剤選択により14個の組換え体を得た。これらの組換え体からゲノムDNAを抽出し、種々のPCRで組換え部位、RNA干渉コンストラクトの存在を確認した。次に、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローンすべてがゲノム中のlox部位に正確にRFPのRNA干渉コンストラクトをもつことを確認した。さらに、ターゲティングベクター中のCMVプロモーターをプローブとしサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローン中、11クローンが単一コピーの組換え体であり、残り3クローンは2コピー以上の組換え体であることが判明した。ウエスタンブロティング法により14クローンのRFP干渉による蛋白レベルでの変化を解析した結果、どのクローンでも親株に比べ約50%のノックダウンが観察された。興味深いことにRNA干渉コンストラクトを2コピー以上もつ3個の組換え体でも単一コピーをもつ残り11個の組換え体とノックダウン率に大きな違いが見出せなかった。このことは、コピー数よりもRNA干渉を引き起こすshRNAの塩基配列を変える方がより効果的にRNA干渉をおこなえる可能性を示すと考えられる。

This study で は Cre - traces of lox 伝 を scions into the department with い, ゲ ノ ム の on certain parts (former も っ て import し た lox) に 2 lock の siRNA を 発 now す る コ ン ス ト ラ ク ト を right に 単 a コ ピ ー scions into す る こ と に よ っ て, really be に RNA dry involved を お こ な う を purpose the cell lines の cropping と し た. In this year, に単, Ltk- cells に単 a コピ コピ <s:1> <s:1> lox position を containing む cell lines, 73-14を use ウス, ウス ウスRet finger protein (RFP) に す seaborne dry る RNA involved コ ン ス ト ラ ク ト を Cre - traces of lox 伝 son scions into the department に よ り import し た ス テ ー ブ ル し, the cell lines を cropping そ の unseen fruit を parsing し た. ま ず, 73-14 に RFP の RNA dry involved コ ン ス ト ラ ク ト を containing む lox タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー と Cre 発 now プ ラ ス ミ ド を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し, G418 で の 薬 tonic sentaku に よ り 14 の group in え body を た. こ れ ら の group in え body か ら ゲ ノ ム を DNA extraction し, kind of 々 の PCR で group in え parts, RNA dry involved コ ン ス ト ラ ク ト の exist を confirm し た. に, ネ オ マ イ シ ン patience heritage 伝 son を プ ロ ー ブ と し て サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を お こ な い, 14 ク ロ ー ン す べ て が ゲ ノ ム の in lox parts に right に RFP の RNA dry involved コ ン ス ト ラ ク ト を も つ こ と を confirm し た. さ ら に, タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー の in CMV プ ロ モ ー タ ー を プ ロ ー ブ と し サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を お こ な い, 14 ク ロ ー ン, 11 ク ロ ー ン が 単 a コ ピ ー の group in え body で あ り and residual り 3 ク ロ ー ン は 2 コ ピ ー above の group in え body で あ る こ と が.at し た. ウ エ ス タ ン ブ ロ テ ィ ン グ method に よ り 14 ク ロ ー ン の RFP dry involved に よ る protein レ ベ ル で の variations change を parsing し た results, ど の ク ロ ー ン で も parent strain に than about 50% の べ ノ ッ ク ダ ウ ン が 観 examine さ れ た. Takes deep い こ と に RNA dry involved コ ン ス ト ラ ク ト を 2 コ ピ ー above も つ three の group in え body で も 単 a コ ピ ー を も つ residual り 11 の group in え body と ノ ッ ク ダ ウ ン rate に big き な violations い が shows せ な か っ た. こ の こ と は, コ ピ ー number よ り も RNA dry involved を lead き up こ す shRNA の salt base with column を - え る party が よ り unseen dry fruit に RNA involved を お こ な え を る possibility in す と exam え ら れ る.

项目成果

The thymine DNA glycosylase MBD4 represses transcription and is associated with methylated p16INK4a and hMLH1 genes

• DOI: 10.1128/mcb.25.11.4388-4396.2005
• 发表时间: 2005-06-01
• 期刊: MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.3
• 作者: Kondo, E;Gu, ZD;Fukushige, S
• 通讯作者: Fukushige, S

RET finger protein enhances MBD2-and MBD4-dependent transcriptional repression

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2006.10.005
• 发表时间: 2006-12-08
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Fukushige, Shinichi;Kondo, Emiko;Horii, Akira
• 通讯作者: Horii, Akira